ინფორმაცია

როგორ მოქმედებს შიგნითა მაკორექტირებელი კალიუმის არხები გულში?

როგორ მოქმედებს შიგნითა მაკორექტირებელი კალიუმის არხები გულში?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

როგორც ჩანს, კარდიომიოციტებში არის შიგნით შემავალი კალიუმის არხი, რომელიც მოქმედებს კარდიომიოციტების მოქმედების პოტენციალის მე -4 ფაზაზე. მე გამიგია, რომ მიუხედავად იმისა, რომ ამ კალიუმის არხს უწოდებენ შინაგანი გასასწორებელი არხი, რომ ინ ვიტრო ფაქტობრივად, არხი კვლავ ატარებს კალიუმს შიგნიდან უჯრედის გარეთ. როგორც ჩანს, ვიკიპედია სხვაგვარად გვთავაზობს (?).

იქნებ ვინმემ ამიხსნას, რას აკეთებს კალიუმის არხი შინაგანი გამომსწორებელი და მისი როლი მიოციტების მოქმედების პოტენციალის მე-4 ფაზაში?


ბორის სამედიცინო ფიზიოლოგიის სახელმძღვანელოს მიხედვით:

"მიუხედავად იმისა, რომ კალიუმის შიგნითა გასასწორებელი არხები უკეთესად გადის შინაგანს, ვიდრე გარე მიმართულებით, მემბრანის პოტენციალი (Vm), როგორც წესი, არასოდეს არის უფრო უარყოფითი ვიდრე Ek (კალიუმის წონასწორობის პოტენციალი გარსზე). ამრიგად, სუფთა შინაგანი K+ დენი არ ხდება ფიზიოლოგიურად შედეგად, GIRK არხების გააქტიურება (G ცილა დაწყვილებული შინაგანად ასწორებს კალიუმის არხს) ახდენს გულის უჯრედების ჰიპერპოლარიზაციას K+ გამტარობის გაზრდით ან გამავალი K+ დენის გაზრდით."


თაგვის გულიდან კლონირებული კალიუმის არხის კლონირებული შიგნითა შიდა მექანიზმი

შინაგანი მაკორექტირებელი კალიუმის არხის მაკოდირებელი დამატებითი დნმ კლონირებული იქნა მოზრდილი თაგვის გულიდან პოლიმერაზული ჯაჭვური რეაქციის გამოყენებით. კლონს ჰქონდა ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობა IRK1 გენის იდენტური, რომელიც კლონირებულია თაგვის მაკროფაგის უჯრედული ხაზიდან. ჩრდილოეთის ბლოტის ანალიზმა აჩვენა, რომ ამ გენის ტრანსკრიპტი ძირითადად გამოხატული იყო პარკუჭში, სადაც შიგნიდან გამომსწორებელი K + არხი თამაშობს უპირატეს როლს მოსვენებული მემბრანის პოტენციალის მაღალი უარყოფითი მნიშვნელობის შენარჩუნებაში. მიმდინარეობა გამოხატულია კლონირებული გენის დამატებითი რნმ -ის ინექციით ქსენოპუსი ოოციტებმა აჩვენეს შინაგანი შესწორება, რაც დამოკიდებულია K + - ის მამოძრავებელ ძალაზე. ნაკადის უარყოფითი გამტარობის რეგიონი დაფიქსირდა მიმდინარე ძაბვის ურთიერთობაში შემობრუნების პოტენციალზე პოზიტიური პოტენციალებით. როდესაც უჯრედგარე K + კონცენტრაცია გაიზარდა, გამავალი დენის ამპლიტუდის ზრდამ გამოიწვია გარე დენის ძაბვის ურთიერთობების „გადაკვეთა“. მიმდინარე ამპლიტუდის დროზე სწრაფად დამოკიდებული ზრდა დაფიქსირდა მემბრანის რეპოლარიზაციისას პოტენციური პოზიტივიდან შემობრუნების პოტენციალზე. დროზე დამოკიდებული დენის კინეტიკა ძალიან ჰგავდა გულის შინაგანი რექტიფიკატორის K + არხის შიდა კარიბჭის მექანიზმს. ჩვენი შედეგები გვთავაზობს შინაგანი გამწოვი მექანიზმის არსებობას, რაც ითვალისწინებს მიმდინარე ძაბვის ურთიერთობის გამოსწორების ხარისხს გამოხატულ არხში.

ეს არის ხელმოწერის შინაარსის გადახედვა, თქვენი დაწესებულების საშუალებით წვდომა.


შინაგანი გასწორების მექანიზმი

კ -ის შინაგანი გასწორებაირ არხები არის ენდოგენური პოლიამინების, კერძოდ სპერმინისა და მაგნიუმის იონების მაღალი აფინიტური ბლოკირების შედეგი, რომლებიც არხის ფორებს უფრო პოზიტიურ პოტენციალს ხდის. მიუხედავად იმისა, რომ პოლიამინის ბლოკის ძირითადი იდეა გასაგებია, კონკრეტული მექანიზმები უცნობია. ამრიგად, როდესაც მემბრანის პოტენციალი ხდება ნაკლებად უარყოფითი (დეპოლარიზაცია), არხი იბლოკება და კალიუმის ნაკადი შეზღუდულია. ეს ამცირებს გარე მიმდინარეობას (შინაგანი დენის გავლენის გარეშე) იწვევს იმაზე, რომ მეტი წმინდა მიმდინარეობა გადადის შიგნით, ვიდრე გარედან, აქედან გამომდინარე, დენის შიდა გასწორება.


Digital Commons @ RU

გულისცემა მჭიდროდ რეგულირდება ავტონომიური ნერვული სისტემის სიმპათიკური და პარასიმპათიკური ტოტების კომბინირებული ეფექტებით. ეს ორი ტოტი აკონტროლებს გულისცემას სხვადასხვა G პროტეინთან დაწყვილებული რეცეპტორების (GPCRs) სტიმულირებით, რომლებიც თავის მხრივ ააქტიურებენ იონურ არხებს, რომლებიც ცვლიან გულის კარდიოსტიმულატორის უჯრედების ელექტრულ თვისებებს. სიმპათიური სტიმულაცია აჩქარებს გულისცემას ბეტა-ადრენერგული რეცეპტორების (βARs) გააქტიურების გზით, რომლებიც ხსნიან აღმგზნებ იონურ არხებს მასტიმულირებელი G ცილის (Gαs) გზით. პარასიმპათიკური სტიმულაცია ანელებს გულისცემას კუნთოვანი აცეტილქოლინის რეცეპტორის M2 (M2Rs) გააქტიურებით, რაც აფერხებს სიმპათიკური სტიმულაციის ეფექტს G ცილის (Gαi) ინჰიბიტორული გზით. M2R-ები ასევე ათავისუფლებენ G პროტეინის ბეტა-გამა ქვედანაყოფებს (Gβγ), რომლებიც ანელებენ გულისცემის სიხშირეს G ცილებით შემოსაზღვრული კალიუმის (GIRK) არხების გააქტიურებით. საინტერესოა, რომ βARs ასევე ათავისუფლებს იგივე უფასო Gβγ- ს, მაგრამ GIRK არ არის გააქტიურებული. ამ სპეციფიკის მოლეკულური მექანიზმი ცუდად არის დახასიათებული. რა არის მოლეკულური საფუძველი სიგნალის სპეციფიკის მიღმა? შემოთავაზებულია, რომ GIRK არხები ქმნიან მაკრომოლეკულურ სუპერკომპლექსს Gai-დაწყვილებული რეცეპტორებით და G პროტეინებით, რაც საშუალებას აძლევს გამოთავისუფლებულ Gβγ დაუკავშირდეს და გაააქტიუროს GIRK სიახლოვით. თუმცა კომპლექსის არსებობის მტკიცებულება საკამათო რჩება. ჩემი თეზისის პირველ ნაწილში, მე გამოვრიცხავ სუპერკომპლექსურ ჰიპოთეზას თეორიის საწინააღმდეგოდ სამი ექსპერიმენტული კომპლექტის მიწოდებით. პირველი, GIRK-ის კოლოკალიზაცია GPCR-ებთან არ აჩვენებს M2R-ების უპირატესობას β2AR-ებთან შედარებით. მეორე, β2ARs არ ააქტიურებს GIRK არხებს მაშინაც კი, როდესაც ისინი ლოკალიზებულია. მესამე, არც Gai1 და არც G პროტეინის ჰეტეროტრიმერები ფუნქციურად არ ურთიერთქმედებენ გასუფთავებულ GIRK1/4 არხებთან პლანტურ ლიპიდურ ორშრიანი სისტემაში. მე დავასკვენი, რომ ცილის თანა ლოკალიზაცია არ არის ძირითადი მექანიზმი იმის ახსნისთვის, თუ რატომ არის GIRK არხები სპეციალურად გააქტიურებული Gαi- თან დაწყვილებული რეცეპტორებით. შემდეგ მე განვსაზღვრე სიგნალის სპეციფიკის მოლეკულური საფუძვლის განსაზღვრა. ელექტროფიზიოლოგიური ტექნოლოგიებისა და ბიოლუმინესცენტური რეზონანსული ელექტრონების გადაცემის (BRET) ანალიზების გამოყენებით, მე ვაჩვენებ, რომ M2Rs კატალიზაციას ახდენს Gβγ ქვედანაყოფების უფრო მაღალი სიჩქარით, ვიდრე β2ARs, წარმოქმნის უფრო მაღალ Gβγ კონცენტრაციებს, რომლებიც ააქტიურებენ GIRK-ს და არეგულირებენ Gβγ-ის სხვა სამიზნეებს. Gβγ გათავისუფლების უფრო მაღალი სიჩქარე მიეკუთვნება GPCR-G ცილის უფრო სწრაფ ასოციაციურ სიჩქარეს M2R-ებში β2AR-ებთან შედარებით. მე დავასკვენი, რომ GIRK არხების აქტივობა უბრალოდ განისაზღვრება Gβγ გამოშვების ეფექტურობით GPCR-ებიდან. ფიზიოლოგიურად, მხოლოდ Gαi დაწყვილებულ რეცეპტორებს შეუძლიათ უზრუნველყონ Gβγ- ის საკმარისი კონცენტრაცია GIRK არხების გასააქტიურებლად. ჩემი თეზისის მეორე ნაწილში, მე წარმოვადგენ ჩემს მუშაობას ორი GIRK არხის GVγ და Na+ რეგულირების ფუნქციურ დახასიათებაზე, GIRK1/4 ჰეტერო-ტეტრამერებსა და GIRK4 ჰომო-ტეტრამერებზე. ცნობილია, რომ გულის GIRK არხები შედგება GIRK1/4 ჰეტერომეტრამერების და GIRK4 ჰომო-ტეტრამერებისგან. თუმცა ცოტა რამ არის ცნობილი ორ არხს შორის ფუნქციონალური განსხვავების შესახებ. გასუფთავებული ცილების და პლანური ლიპიდური ორშრიანი სისტემის გამოყენებით, მე აღმოვაჩინე, რომ Na+-ის შეკავშირება ზრდის Gβγ აფინურობას GIRK4 ჰომო-ტეტრამერებში და ამით ზრდის GIRK4 რეაგირებას G ცილის სტიმულაციაზე. GIRK1/4 ჰეტეროტეტრამერები არ არის გააქტიურებული Na+-ით, არამედ არიან მუდმივი მაღალი რეაქციის მდგომარეობაში Gβγ-ზე, რაც ვარაუდობს, რომ GIRK1 ქვედანაყოფი ფუნქციონირებს GIRK4 ქვეგანყოფილების მსგავსად Na+ მუდმივად შეკრული.

კომენტარები

როზფელერის უნივერსიტეტის ფაკულტეტზე წარმოდგენილი თეზისი ფილოსოფიის დოქტორის ხარისხის მოთხოვნების ნაწილობრივ შესრულებაში


K არხების მოლეკულური სტრუქტურა

მოლეკულური ბიოლოგიური ტექნიკა წარმატებული იყო ამინომჟავების თანმიმდევრობების შესახებ დეტალური ინფორმაციის წარმოებაში, რომლებიც შეიცავს იონური არხის ცილებს. დნმ-ის თანმიმდევრობის კლონირება, რომელიც კოდირებს ახალ იონურ არხს, ჩვეულებრივ ხდება მისი ცილის თანმიმდევრობის ცოდნით, ან მისი სპეციფიკური ელექტროფიზიოლოგიური ფუნქციის დაკვირვებით ფუნქციურ ანალიზში კონკრეტული გენის იდენტიფიცირებისთვის. ელექტროფიზიოლოგებმა მნიშვნელოვანი როლი ითამაშეს ამ პროცესში იმით, რომ პირველად დაადგინეს კონკრეტული დენი კონკრეტულ უჯრედში, რომლის წყაროც შეიძლება იყოს ახალი კლონირებული თანმიმდევრობა.

მას შემდეგ, რაც გამოვლინდა სრულმეტრაჟიანი კლონი, ერთ – ერთი მთავარი მცდელობაა იმის გაგება, თუ როგორ უკავშირდება აღმოჩენილი თანმიმდევრობა სხვა ცნობილ არხებს და რომელი თანმიმდევრობა განაპირობებს სპეციფიკურ ფუნქციებს. კლონირებული არხების ამ ანალიზის შედეგად წარმოიშვა არის ურთიერთდამოკიდებულების და მრავალფეროვნების სურათი.

მოტივები ან სტრუქტურული დომენები, რომლებიც ნაპოვნია ძაბვის ბლოკირებულ K არხებში

შეიკერის არხის კლონირებამ გასცა პირველი შესაძლებლობა K არხის პირველადი ამინომჟავების თანმიმდევრობის ანალიზისთვის. ამავდროულად, სხვა მკვლევარები კლონირებდნენ ძაბვით დაცულ ნატრიუმის (Na) და კალციუმის (Ca) არხებს [4,5] და მაშინვე გაირკვა, რომ ყველა ამ არხის ფუნდამენტური სტრუქტურები მჭიდროდ იყო დაკავშირებული. ძაბვის გადიდებული Na ან Ca არხის ცილები შედგება დიდი უწყვეტი თანმიმდევრობისგან, რომელიც ასახავს ოთხ განმეორებით ელემენტს, რომელთაგან თითოეული ჰომოლოგიურია ერთი Shaker ცილისთვის (სურათი 1A). ითვლება, რომ ამ სტრუქტურული ელემენტებიდან ერთ -ერთი გარშემორტყმულია მემბრანაზე ექვსჯერ (სურათი 1B). ახლა უკვე მტკიცედ არის დადგენილი, რომ ოთხი შაკერის ცილაა საჭირო ძაბვის მქონე კალიუმის ფუნქციური არხის (K V) შესაქმნელად, [6] ამგვარად წარმოქმნის სტრუქტურას, რომელიც მსგავსია ძაბვით გადიდებული Na და Ca არხებისა, რომელიც იყოფა ქვედანაყოფებად.

სურათი 1. K არხების კონსერვატიული სტრუქტურა. ძაბვის შემცველი Na და Ca არხების (A) პირველადი ამინომჟავების თანმიმდევრობა აჩვენებს განმეორებითი დომენის სტრუქტურას, რომელიც ჰომოლოგიურია ინდივიდუალური ძაბვის გარსით დაფარული K არხის ქვედანაყოფებში (B). ამინომჟავების ჯაჭვის ცილინდრული სეგმენტები წარმოადგენს არხის ცილის სტრუქტურის ალფა-ხვეული ტრანსმემბრანულ კომპონენტებს. პორები ან H5 დომენი არის უაღრესად დაცული მახასიათებლები al K არხებში, რომლებიც გვხვდება ორ კონსერვატიულ ტრანსმემბრანულ სეგმენტს შორის (S5 და S6). ძაბვით შემოსაზღვრულ ქვედანაყოფებს ასევე აქვთ ოთხი სხვა მემბრანული დომენი, რომლებიც გრძნობენ მემბრანის პოტენციალის ცვლილებებს (ძირითადად დამუხტულ ნარჩენებს S4-ში). ამინო (N)- და კარბოქსი (C)-ბოლოები ხელს უწყობენ მცირე მოლეკულების ინაქტივაციას და მოდულაციას (Ca (++) და ATP). ჩასმა: ხედი ზემოდან მემბრანის სიბრტყის (უჯრედგარე მხარე), რომელიც ასახავს, ​​თუ როგორ შეიძლება განლაგდეს ოთხი K არხის ქვედანაყოფი ცენტრალური ფორის შესაქმნელად და როგორ არის შეფუთული თითოეული ქვედანაყოფის ექვსი ტრანსმემბრანული სეგმენტი. სტრუქტურული მოდელი დურელისა და გაიის მიხედვით. [103]

სურათი 1. K არხების კონსერვატიული სტრუქტურა. ძაბვის შემცველი Na და Ca არხების (A) პირველადი ამინომჟავების თანმიმდევრობა აჩვენებს განმეორებითი დომენის სტრუქტურას, რომელიც ჰომოლოგიურია ინდივიდუალური ძაბვის გარსით დაფარული K არხის ქვედანაყოფებში (B). ამინომჟავის ჯაჭვის ცილინდრული სეგმენტები წარმოადგენს არხის ცილის სტრუქტურის ალფა-სპირალ ტრანსმემბრანულ კომპონენტებს. პორები ან H5 დომენი არის უაღრესად დაცული მახასიათებლები al K არხებში, რომლებიც გვხვდება ორ კონსერვატიულ ტრანსმემბრანულ სეგმენტს შორის (S5 და S6). ძაბვით შემოსაზღვრულ ქვედანაყოფებს ასევე აქვთ ოთხი სხვა მემბრანული დომენი, რომლებიც გრძნობენ მემბრანის პოტენციალის ცვლილებებს (ძირითადად დამუხტულ ნარჩენებს S4-ში). ამინო (N)- და კარბოქსი (C)-ბოლოები ხელს უწყობენ მცირე მოლეკულების ინაქტივაციას და მოდულაციას (Ca (++) და ATP). ჩასმა: ხედი ზემოდან მემბრანის სიბრტყის (უჯრედგარე მხარე), რომელიც ასახავს, ​​თუ როგორ შეიძლება განლაგდეს ოთხი K არხის ქვედანაყოფი ცენტრალური ფორის შესაქმნელად და როგორ არის შეფუთული თითოეული ქვედანაყოფის ექვსი ტრანსმემბრანული სეგმენტი. სტრუქტურული მოდელი დურელისა და გაიის მიხედვით. [103]

გენები, რომლებიც კოდირებენ ძაბვის მქონე არხებს K, წარმოდგენილია არა მხოლოდ დროზოფილაში, არამედ ძუძუმწოვრებშიც და ისინი აღიარებულია, როგორც K არხები, კონსერვატიული ხელმოწერის ამინომჟავების თანმიმდევრობით. ეს სტრუქტურა, სახელწოდებით "H5" ან "ფორების" დომენი, გვხვდება დღემდე კლონირებულ ყველა K არხში და ითვლება, რომ ქმნის იონგამტარი გზის გარსს. ფორების წარმომქმნელ თანმიმდევრობაში სპეციფიური მუტაციების ექსპერიმენტებმა დაადგინა, რომ ეს აუცილებელია არხის კალიუმის სელექციურობისთვის და K არხის ბლოკატორის TEA +-ის დასაკავშირებლად. [7] ამიტომ, ამ ხელმოწერის თანმიმდევრობის პოვნა განსაზღვრავს ახალ კლონს, როგორც K არხს.

კიდევ ერთი კონსერვატიული თვისება გვხვდება მემბრანის მეოთხე სეგმენტში (S4). ნაპოვნი ყველა ძაბვით დახურულ იონურ არხებში, მათ შორის Na და Ca არხებში, S4 დომენები შეიცავს დადებითად დამუხტულ ამინომჟავას ნარჩენებს, რაც მათ საშუალებას აძლევს მონაწილეობა მიიღონ მემბრანის პოტენციალის ცვლილებების "შეგრძნებაში". დამუხტული ამინომჟავები ცვლის ორიენტაციას მემბრანის დეპოლარიზაციის დროს იონგამტარი გზის გასახსნელად. ამ დამუხტული ნარჩენების მოძრაობა შეიძლება განისაზღვროს, როგორც პატარა გამავალი დენები.

მას შემდეგ, რაც შეიკერის კლონირება მოხდა, უფრო მეტი გენები, რომლებიც კოდირებენ ძაბვის კარის არხების ქვეგანყოფილების მრავალფეროვნებაზე, იზოლირებულია. ისინი დაჯგუფებულია ოთხ ქვეოჯახად მათი ამინომჟავების თანმიმდევრობის მსგავსების და იმის მიხედვით, შეიკრიბება თუ არა ისინი სხვა ქვედანაყოფებთან (ცხრილი 1). მაგალითად, შეიკერის ქვეოჯახის ყველა წევრს აქვს მათი პირველადი ამინომჟავების თანმიმდევრობის 60% -ზე მეტი იდენტურია სხვა შაკერის ქვედანაყოფებთან, თუმცა შაბის ქვეოჯახის წევრებთან შედარებით, შეიკერის წევრები მხოლოდ 40% ჰომოლოგიურია. გარდა ამისა, შეიკერის ქვედანაყოფები ვერ გაერთიანდებიან შაბის ქვედანაყოფებთან (და არც შაუ ან შალის ქვეოჯახის წევრებთან), რათა წარმოქმნან ფუნქციურ იონურ არხებს.

ცხრილი 1. K არხის ოჯახები

3u9zyqmY71w9yYK85yiZ2mMV96jcJAGO4g __ & ampKey-Pair-Id = APKAIE5G5CRDK6RD3PGA " />

ბოლო წლებში გამომძიებლებმა ასევე აღმოაჩინეს ცილის სხვა თანმიმდევრობა ძაბვის შემორჩენილ ქვედანაყოფებთან ჰომოლოგიის გარეშე, მაგრამ შეიძლება ნაჩვენები იყოს მათთან ერთად და მათი ფუნქციის მოდულირება. როდესაც ძუძუმწოვრების ტვინიდან გაწმენდილია ავთენტური K არხები, დიდი მოლეკულური კომპლექსები (მოლეკულური წონა, დაახლოებით 400 კდ) იზოლირებულია. ნაჩვენები იყო, რომ ეს მაკრომოლეკულური კომპლექსები შეიცავდა რვა ინდივიდუალურ ცილას, რომელიც წარმოადგენს ორი განსხვავებული ცილის ტიპის ოთხ ასლს. [8] ოთხი ძაბვით დახურული K არხის ქვედანაყოფი ([ბერძნული მცირე ასო ალფა] ქვედანაყოფი) აღმოჩნდა, რომ ასოცირდება ახალი ცილის ოთხ ასლთან, რომელსაც ეწოდება [ბერძნული მცირე ასო ბეტა] ქვედანაყოფი. გენების შემდგომმა კლონირებამ [ბერძნული მცირე ასო ბეტა] 1, [ბერძნული მცირე ასო ბეტა] 2 და [ბერძნული მცირე ასო ბეტა] 3 ქვეერთეულებისთვის გამოავლინა ახალი თანმიმდევრობები ამ ჰიდროფილური პროტეინებისთვის სხვა K არხებთან ჰომოლოგიის გარეშე. [ბერძნული მცირე ასო ბეტა] 1-ის თანაგამოხატვა Shaker-ის ქვეოჯახის [ბერძნული მცირე ასო ალფა] ქვეერთეულებთან, როგორც ჩანს, ცვლის მათ ფუნქციას K + დენის ინაქტივაციის აჩქარებით.

K Channel-ის სხვა ოჯახები

Ca ++-გააქტიურებული K არხები (K Ca) სტრუქტურულად ჰგავს ძაბვის კარის არხებს. 1960-იან წლებში ელექტროფიზიოლოგებმა გამოავლინეს K დენები რამდენიმე ქსოვილში, რომლებიც არა მხოლოდ ძაბვის მოქმედებით იყვნენ გააქტიურებულნი, არამედ მათი ღია ალბათობა ასევე რეგულირდება უჯრედშიდა Ca ++ კონცენტრაციით. ეს ნაკადები გვხვდება ხერხემლიანთა ნეირონებში, კუნთებსა და სეკრეტორულ უჯრედებში და ძლიერ აფერხებს ხარიბდოტოქსინი, მორიელის შხამიდან გამოყოფილი ტოქსინი. დროზოფილას კუნთში ამ Ca ++ გააქტიურებული დენის დაკარგვა წარმოშობს შენელებულ ფენოტიპს. [9]როდესაც მოხდა ამ არხის კოდირების გენის კლონირება, აღმოჩნდა, რომ მის სტრუქტურას აქვს მრავალი საერთო ელემენტი Shaker-ის ტიპის ქვედანაყოფებთან, მათ შორის H5 და S4 დომენებთან, მაგრამ გარდა ამისა, ეს თანმიმდევრობა ასევე კოდირებულია ხანგრძლივი გაფართოებისთვის. ცილის კარბოქსი-ტერმინალური დასასრული, რომელიც ვარაუდობს, რომ ფუნქციონირებს Ca ++ დონის შეგრძნებაში ან სხვა მცირე მოლეკულების მოდულაციაში (სურათი 1 ბ). ამ არხების ურთიერთობა ერთმანეთთან უფრო ნათელი გახდა გენომის თანმიმდევრობის პროექტებიდან მიღებული ახალი ინფორმაციისათვის (განსახილველია).

შიდა გასწორება K არხები. კიდევ ერთი K არხის ოჯახი, შინაგანი მაკორექტირებლები (K ir), შეიძლება ჩაითვალოს, როგორც ძაბვის ტიპის არხის "ფუნქციური ფრაგმენტი" (სურათი 2A, მარცხნივ). აქ კონსერვირებული ფორების დომენი აკავშირებს ორ ტრანსმემბრანულ თანმიმდევრობას. [10] ეს მემბრანის შემცველი თანმიმდევრობა არის ერთადერთი, რომელიც წარმოდგენილია შინაგანი მაკორექტირებელი თანმიმდევრობით და ჰომოლოგიურია შეკერის S5 და S6 ტრანსმემბრანული სეგმენტების მიმართ. შინაგან მაკორექტირებლებს აქვთ უნიკალური ელექტროფიზიოლოგიური თვისებები (განსახილველია), რაც მათ აუცილებელს ხდის ბევრ ქსოვილში მემბრანის პოტენციალის სტაბილიზაციისათვის.

ნახაზი 2. შიდა გამსწორებელი (მარცხნივ) და ტანდემური ფორების დომენის (მარჯვნივ) K არხების ტრანსმემბრანული ტოპოლოგია. ბოლოში ნაჩვენებია შიდა გამსწორებელი K არხის მოდელის ამოჭრილი მონაკვეთი, რომელიც აჩვენებს ფორების დაფარვის (H5) დომენის სავარაუდო ურთიერთობას მიმდებარე ტრანსმემბრანულ სეგმენტებთან. მაგნიუმის იონები და პოლიამინები ბლოკავს გარე K დენებს იონური არხის უჯრედშიდა მხრიდან.

ნახაზი 2. შიგნითა მაკორექტირებელი (მარცხნივ) და ტანდემური ფორების დომენის (მარჯვნივ) K არხების ტრანსმემბრანული ტოპოლოგია. ბოლოში ნაჩვენებია შიგნითა მაკორექტირებელი K არხის მოდელის მოწყვეტილი მონაკვეთი, რომელიც აჩვენებს პორების უგულებელყოფის (H5) დომენის სავარაუდო ურთიერთობას მიმდებარე ტრანსმემბრანულ სეგმენტებთან. მაგნიუმის იონები და პოლიამინები ბლოკავს გარე K დენებს იონური არხის უჯრედშიდა მხრიდან.

მოდელი იმისა, თუ როგორ იკრიბება უჯრედის მემბრანაში შინაგანი მაკორექტირებელი არხი ნაჩვენებია ნახატ 2B- ში. ტრანსმემბრანული სეგმენტები (M1 და M2) პასუხისმგებელნი არიან ცილის ინტეგრაციის შენარჩუნებაზე ლიპიდური მემბრანის ჰიდროფობიურ გარემოში, ხოლო H5 რეგიონი ფიქრობს, რომ ქმნის ძაბრის ან „ინვერსიული ტეპის“ ტიპის სტრუქტურას [11] და შუამავლებს K + იონები შერჩევით. შიგნითა მაკორექტირებელი K არხები შიგნიდან იბლოკება მაგნიუმის (Mg ++) იონებით და პოლიამინის ნაერთებით, როგორიცაა სპერმინი და სპერმიდინი, რაც იწვევს არხის მოქმედებას ცალმხრივი ქუჩის მსგავსად, რაც K + იონებს უჯრედში შეუშვებს. თავისუფლად, მაგრამ შეზღუდულად არსებობს (იხილეთ გამოსწორების განხილვა).

Tandem Pore Domain K არხები. K არხების ოჯახებში უახლესი დამატება იყო ჯგუფი, რომლის არსებობა მხოლოდ ბოლო 3 წლის განმავლობაში გაჩნდა. ამ ტიპის პროტოტიპული K არხი პირველად ნაპოვნი იქნა მცხობელის საფუარში (TOK1) და მაშინვე აღიარებულ იქნა, როგორც უნიკალური, რადგან იგი შეიცავდა ორ ფორს ან H5 თანმიმდევრობას ერთდროულად ამინომჟავის პირველადი თანმიმდევრობით. [12] მოდელი იმის შესახებ, თუ როგორ არის განლაგებული პორტალების K არხები პლაზმის მემბრანის მიმართ, ნაჩვენებია ნახატზე 2A მარჯვნივ. მას შემდეგ, რაც TOK1 პირველად იქნა აღწერილი, ოთხი ძუძუმწოვარი (TWIK-1, TREK-1, TASK და TRAAK) და ერთი დროზოფილა (ORK1) ტანდემი ფორების K არხი იქნა იზოლირებული. [13-18] როგორც ჩანს, ეს არხები პასუხისმგებელნი არიან საწყისი ან გაჟონვის დენებზე და რომ ისინი შეიძლება იყოს ყველაზე მრავალრიცხოვანი ყველა K არხიდან.

რამდენი განსხვავებული K არხი არსებობს ადამიანის ორგანიზმში? ცხრილი 1 ჩამოთვლის დღემდე კლონირებულ K არხებს და აჯგუფებს მათ ადრე წარმოდგენილ სტრუქტურულ ოჯახებს. შეფასებები იმის შესახებ, თუ რამდენი არხი არსებობს, ჩნდება პროექტებიდან, რომლებიც ეძღვნება უფრო მარტივი ორგანიზმების მთელი გენომის თანმიმდევრობას. სრული თანმიმდევრობის ინფორმაცია ახლა ცნობილია მრავალი ვირუსისთვის, რამდენიმე ბაქტერიისთვის, მათ შორის Escherichia coli, Hemophilus influenzae და Helicobacter pylori და ერთუჯრედიანი ევკარიოტი Saccharomyces cerevisiae (საფუარი). "უმაღლესი" ორგანიზმებისთვის, თანმიმდევრობის 50% -ზე მეტი ცნობილია ნემატოდით Caenorhabditis elegans და გენომის რამდენიმე პროცენტი უფრო რთული ცენტრალური ნერვული სისტემის მქონე ორგანიზმებისათვის, როგორიცაა თაგვი და ადამიანი. C. elegans იქნება პირველი მრავალუჯრედიანი ორგანიზმი, რომლის თანმიმდევრობა სრულად არის განსაზღვრული. [19] ჯერჯერობით, C. elegans გენომში გამოვლენილია 45 -ზე მეტი K არხი, რომლებიც წარმოადგენენ ოთხივე ძირითად K არხის ოჯახს. [20] K არხის თანმიმდევრობების ეს რაოდენობა ერთი შეხედვით არაპროპორციულია, რადგან C. elegans ნერვული სისტემა ასე მარტივია (სულ 308 ნეირონი). ტანდემური ფორების დომენის ჯგუფი ყველაზე დიდია, K არხების ნახევარზე მეტი ამ ტიპისაა. იმის გამო, რომ არსებობს მრავალი ნემატოდის გენი, რომლებსაც აქვთ პირდაპირი ჰომოლოგები მაღალ ორგანიზმებში, [21-23] არსებობს მოლოდინი, რომ C. elegans K არხების სრული პანოპლია, თუ არა მეტი, ასევე წარმოდგენილი იქნება უფრო რთულ ნერვულ სისტემებში. გაღიზიანებული ქსოვილების ფუნქციაში მათი როლების გასაგებად, ჩვენ შემდეგ განვიხილავთ მათ ძირითად ელექტროფიზიოლოგიურ ქცევას.


დისკუსია

წინა კვლევებმა აჩვენა, რომ მეK1 თაგვის გულებში არხები წარმოიქმნება K– ის ჰეტერომერული შეკრებითir2.1 და კir2.2 ქვედანაყოფები (ზარიცკი და სხვებირა 2001). ვინაიდან თაგვის ეს კვლევები გართულდა პოტენციური კომპენსატორული ადაპტაციით, რაც ხდება გენის აბლაციის შემდეგ, ჩვენ შევეცადეთ პარკუჭის მოლეკულური საფუძვლის შესწავლა. მეK1 დომინანტური ნეგატიური კ-ის ვირუსით გამოწვეული ზედმეტი გამოხატვის გამოყენებითir2 ქვედანაყოფები ჩვენმა Western blotting-ის შედეგებმა აჩვენა, რომ კir2.1 და კir2.2, მაგრამ არა კir2.3, გამოხატულია კურდღლის პარკუჭოვანი მიოციტებით, რაც შეესაბამება წინა mRNA გაზომვებს თაგვში (კურაჩი და თაკაჰაში, 1996) და ვირთხებში (ნაგაშიმა და სხვებირა 2001). ეს დასკვნები ასევე მსგავსია გვინეა-გოჭის მიოციტებზე დაფუძნებული შედეგების ერთობლიობის გამოყენებით მეK1 ამპლიტუდის განაწილება (ლიუ და სხვებირა 2001) და ადამიანის მიოკარდიუმში (ვანგ და სხვებირა 1998) აჩვენებს, რომ კir2.1 და კir2.2 არის გულის ძირითადი განმსაზღვრელი ფაქტორები მეK1, ძალიან მცირე, მაგრამ გაზომვადი, წვლილი კir2.3 არხები.

კურდღლის პარკუჭოვანი მიოციტების ტრანსფექცია კir2.1dn, კir2.2dn ან კir2.1dn+ კir2.2dn შემცირდა მეK1 დონეები იმავე რაოდენობით კულტურის 72 საათის შემდეგ, ხოლო კir2.3dn ზედმეტ გამოხატვას არანაირი ეფექტი არ მოჰყოლია. დენის შემცირება იმავე დონეზე არ იქნება მოსალოდნელი, თუ მნიშვნელოვანი პროპორციები იქნება მეK1 არხები შეიცავდა კir2.1 ან კir2.2 ქვედანაყოფები, როგორც ჰომოტეტრამერები ან (შესაძლოა) ჰეტეროტეტრამერები სხვა დაუდგენელი Kირα-ქვეერთეულები. ჰეტეროტეტრამერული შეკრება ასევე შეესაბამება ჩვენს დაკვირვებას, რომლის ბლოკადაც მეK1 Ba 2+ აღწერილია ერთჯერადი, ვიდრე ორმაგი, სავალდებულო იზოთერმული განტოლებით IC– დან50 Ba 2+ განსხვავდება K– დან 5 – დან 10 – ჯერir2.1 და კir2.2 ჰომომერები (ლიუ და სხვებირა 2001 პრეისიგ-მიულერი და სხვებირა 2002). მსგავსი ჰეტეროტეტრამერული შეკრება კv4.2 და კv4.3 ხდება თაგვის გულის ფორმირებაში მერათა (გუო და სხვებირა 2002). გარდა ამისა, კir2.2 ექსპრესია უცვლელი იყო კურდღლის პარკუჭოვანი მიოციტების კულტურის დროს, მიუხედავად დიდი შემცირებისა მეK1 და კir2.1 გამოხატულება. ვინაიდან ჩვენი ვესტერნ ბლოტინგის შედეგები ვერ განასხვავებს კir2 ქვედანაყოფი სარკოლემაში და არასარკოლემურ გარსებში, როგორც ჩანს, კir2.1 ხელს უწყობს ჰეტეროტეტრამერის გადაადგილებას მეK1 არხები ზედაპირის მემბრანაზე, როგორც ეს წინადადება იყო ტრანსგენური თაგვების კვლევებიდან (ზარიცკი და სხვებირა 2001). ამ წინადადების შესაბამისად, კir2.2 ოოციტებსა და tsA201 უჯრედებში გამოხატული დენები ჩვეულებრივ 10-ჯერ ნაკლებია ვიდრე Kir2.1 დენებისა, რნმ-ის ან დნმ-ის თანაბარი დონის მიუხედავად (H. C. Cho & P. ​​H. Backx, გამოუქვეყნებელი მონაცემები), რაც შეიძლება დაკავშირებული იყოს დაკვირვებასთან, რომ დისტალური C ტერმინალის გადატანა K– დანir2.2ir2.1 შემცირებული ზედაპირული გამოხატულება (მა და სხვები. 2001 ).

აღსანიშნავია, რომ ბიოფიზიკური თვისებები მეK1, მათ შორის ბლოკადა Ba 2+ (ანუ IC50 და Hill კოეფიციენტი), არ იცვლება როდის მეK1 შემცირდა კულტივირების შემდეგ ან კ-ით ტრანსფექციის საპასუხოდir2.1dn და/ან კir2.2dnრა ეს დაკვირვება ჰგავს ერთ არხში ცვლილებების არარსებობას მეK1 გამტარობა ან ღია ალბათობა, რომელიც ადრე იყო ნახსენები კურდღლის მიოციტების კულტურის დროს (ველდკამპი და სხვებირა 1999). მიუხედავად იმისა, რომ ეს დასკვნები ამტკიცებს ფიქსირებული სტოიქომეტრიის სასარგებლოდ მეK1 კურდღლის პარკუჭში არსებული არხები, ურთიერთობა არხის სტოიქიომეტრიასა და ბიოფიზიკურ თვისებებს შორის მეK1 სავარაუდოდ, არხები რთული იქნება და შემდგომი კვლევები აშკარად აუცილებელია კურდღლის გულის ზუსტი სტოიქიომეტრიის დასადგენად მეK1.

შემცირების ხარისხი მეK1 სიმჭიდროვე კურდღლის მიოციტებში იგივე იყო 48 ან 72 საათის შემდეგ AdK– სთან ერთად ტრანსფექციის შემდეგir2.1dn და AdKir2.2dnრა უფრო მეტიც, AdK-ის დონის გაორმაგებაir2.1dn და AdKir2.2dn ასევე ვერ შეძლო შემდგომი გამოწვევა მეK1 შემცირება (C. Zobel, H. C. Cho & P. ​​H. Backx, გამოუქვეყნებელი მონაცემები). ეს დაკვირვებები ვარაუდობენ, რომ მაქსიმალური შემცირება მეK1 ჩვენს ექსპერიმენტულ პირობებში შესაძლებელია დაახლოებით 70 %. დარჩენილის მოლეკულური შემადგენლობა მეK1 გაურკვეველია ენდოგენური ბრუნვის სასრული მაჩვენებლების შედეგად მეK1 არხები, დარჩენილი მიმდინარეობა მაინც შეიძლება გენერირდეს კir2.1 და კir2.2 ქვედანაყოფები, თუმცა, ერთი შეხედვით, ეს წინადადება შეუსაბამოა იმ დაკვირვებასთან, რომ დენის შემცირების ხარისხი ექვივალენტი იყო AdKir2.1dn და AdKir2.2dnრა მიუხედავად ამისა, საფიქრებელია, რომ დინამიური ბალანსი ახალი არხის წარმოებასა და DN ტრანსგენის ექსპრესიას შორის მიიღწევა 48-დან 72 საათამდე, განსაკუთრებით თუ DN ტრანსგენის ექსპრესიის დონე მცირდება 48 საათის შემდეგ კულტურაში, როგორც ეს ადრე იყო ნაჩვენები (Parks და სხვებირა 1999 Seharaseyon და სხვებირა 2000). ჩვენი უუნარობა სრულად აღმოფხვრა მეK1 მიოციტებში K- ის გამოყენებითir2.1dn და კir2.2dn ასევე შეიძლება წარმოიშვას არასრული ჩახშობის გამო მეK1მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენი წინა კვლევები ადგენს კir2.1dn კვერცხუჯრედებში (ჩო და სხვებირა 2000). ამ შესაძლებლობის შესაბამისად, კir2.1dn და კir2.2dn იყო ველური ტიპის K– ს ნაკლებად ეფექტური ინჰიბიტორებიir2.X მიმდინარეობა tsA201 უჯრედებში ვიდრე ოოციტებში (ავტორების გამოუქვეყნებელი დაკვირვებები). აქედან გამომდინარე, შესაძლებელია, რომ K- ის სხვა დომინანტური-უარყოფითი არხის მუტანტებიir2.1 და კir2.2 (GYG to AAA) შესაძლოა უფრო ეფექტურად აღმოფხვრას კურდღლის გული მეK1 ჩვენს ექსპერიმენტულ პირობებში და ეს იმსახურებს შემდგომ გამოკვლევას. Ალტერნატიულად, მეK1 რჩება AdK-ით ინფექციის შემდეგir2.1dn და/ან AdKir2.2dn შესაძლოა ნაწილობრივ (ან მხოლოდ) წარმოიშვას არხებიდან, რომლებსაც აკლია Kir2.1 ან კir2.2 არხის ცილა. წინა პუბლიკაციებზე დაყრდნობით (ლიუ და სხვებირა 2001 პრეისიგ-მიულერი და სხვებირა 2002), დარჩენილი კანდიდატის ერთი შესაძლო კანდიდატი იქნებოდა კir2.3 მარტო ან კ-ის სხვა წევრებთან ერთადირ ოჯახი ეს შესაძლებლობა ნაკლებად სავარაუდოა, რადგან ჩვენს კვლევებში ტრანსფუნქცია AdK– ითir2.3dn არ გამოიწვია შემცირება მეK1 და ვესტერნ ბლოტმა არ გამოავლინა მტკიცებულება კir2.3 გამოხატულება. გარდა ამისა, ტრანსფექცია AdK-ითir2.1dn და/ან AdKir2.2dn არ იმოქმედა ბიოფიზიკურ დენ-ძაბვის თვისებებზე ან Ba 2+-ის ბლოკადაზე მეK1 კურდღლის კულტივირებულ მიოციტებში, რაც (როგორც უკვე აღვნიშნეთ) ვარაუდობს, რომ მოლეკულური შემადგენლობა მეK1 არ შეცვლილა შემცირების საპასუხოდ მეK1 ამ ექსპერიმენტებში.

ადრე იყო ვარაუდი, რომ შემცირება მეK1 შემდეგი კულტურა დაკავშირებულია t-ტუბულების სიმკვრივის შესაბამის შემცირებასთან, რომელიც გამოწვეულია კულტურის პირობებით (Christe, 1999). ეს მტკიცება შეესაბამება K-ის დაკვირვებულ ლოკალიზაციასir2.1 (კლარკი და სხვებირა 2001) და კir2.2 (ლეონუდაკის და სხვებირა 2001) t-tubules. თუმცა, ეს მექანიზმი შემცირდა მეK1 კულტურაში იწინასწარმეტყველებდა K-ის გამოხატვის დონის პარალელურ შემცირებასir2.1 და კir2.2, რაც ჩვენს კვლევებში არ დაფიქსირებულა. ცხადია, მექანიზმების იდენტიფიცირება, რომლებიც პასუხისმგებელნი არიან შემცირებაზე მეK1 მიოციტების კულტივირების შემდგომ აუცილებელია შემდგომი გამოკვლევა.

დასასრულს, ჩვენი შედეგები აჩვენებს, რომ ორივე კir2.1 და კir2.2 ფუნქციურად გამოხატულია პარკუჭის კურდღლის მიოციტებში და მაკროსკოპის უპირატეს მოლეკულურ კორელატში მეK1 როგორც ჩანს, ჰეტერომერული არხებია აწყობილი ორივე K-დანir2.1 და კir2.2 ქვედანაყოფები


დაბალი მოსვენების მემბრანის პოტენციალი და დაბალი შიგნითა გამომსწორებელი კალიუმის დენები არ არის hiPSC-დან მიღებული კარდიომიოციტების თანდაყოლილი მახასიათებლები

ადამიანის ინდუცირებული პლურიპოტენტური ღეროვანი უჯრედების (hiPSC) კარდიომიოციტები (CMs) აჩვენებენ ნაკლებ უარყოფით მოსვენების მემბრანულ პოტენციალს (RMP), რაც მიეკუთვნება მცირე შიდა გამომსწორებელ დენებს (IK1). Აქ მეK1 იზომება hiPSC-CMs (საკუთრებისა და კომერციული უჯრედის ხაზი) ​​კულტივირებული როგორც მონო ფენა (ML) ან 3D ინჟინერირებული გულის ქსოვილი (EHT) და, პირდაპირი შედარებისთვის, ადამიანის მარჯვენა წინაგულის (RA) და მარცხენა პარკუჭის (LV) ქსოვილის CM– ში. RMP იზომება იზოლირებულ უჯრედებსა და ხელუხლებელ ქსოვილებში. მეK1 სიმკვრივე ML- და EHT-CM– ში საკუთრების ხაზიდან შესაბამისად იყო LV და RA, შესაბამისად. მეK1 სიმჭიდროვე EHT-CM-ებში კომერციული ხაზიდან 2-ჯერ ნაკლები იყო, ვიდრე საკუთრებაში არსებული ხაზი. RMP ორივე ხაზის EHT- ში მსგავსი იყო RA და LV. რეპოლარიზაციის ფრაქცია და მეკ, აჩ პასუხი საუკეთესოდ იყო დისკრიმინირებული RA და LV– ს შორის და მიუთითებდა უპირატესად პარკუჭოვანი ფენოტიპი hiPSC-CMs/EHT– ში. მონაცემები მიუთითებს, რომ იK1 სულაც არ არის დაბალი hiPSC-CM– ებში და ტექნიკურმა საკითხებმა შეიძლება გამოიწვიოს დაბალი RMP hiPSC-CM– ებში.

საკვანძო სიტყვები: I (K, ACh) I (K1) მოქმედების პოტენციალი ხანგრძლივობა ინჟინერირებული გულის ქსოვილი ადამიანის წინაგულში ადამიანის მიერ გამოწვეული მრავალმხრივი ღეროვანი უჯრედისგან წარმოქმნილი კარდიომიოციტები ადამიანის პარკუჭის შინაგანი მაკორექტირებელი K (+) მიმდინარე რეპოლარიზაციის ფრაქცია დამშვიდებული მემბრანის პოტენციალი.

საავტორო უფლება © 2018 ავტორი (ები). გამოქვეყნებულია Elsevier Inc. ყველა უფლება დაცულია.


ეს კვლევა დაფინანსდა შეერთებული შტატების სოფლის მეურნეობის დეპარტამენტისა და სოფლის მეურნეობის კვლევის სამსახურის (USDA-ARS) მიერ პროექტის ნომრით: 3094-32000-042-00D.

ამ პუბლიკაციაში სავაჭრო სახელების ან კომერციული პროდუქტების ნებისმიერი ხსენება არის მხოლოდ კონკრეტული ინფორმაციის მიწოდების მიზნით და არ გულისხმობს აშშ-ს სოფლის მეურნეობის დეპარტამენტის რეკომენდაციას ან მოწონებას. USDA არის თანაბარი შესაძლებლობების მიმწოდებელი და დამსაქმებელი.

ავტორები აცხადებენ, რომ კვლევა ჩატარდა რაიმე კომერციული ან ფინანსური ურთიერთობების არარსებობის პირობებში, რაც შეიძლება ჩაითვალოს ინტერესთა პოტენციურ კონფლიქტად.


დისკუსია

ამ კვლევაში ჩვენ გამოვიკვლიეთ ტრეფიკინგი, ფიჭური ლოკალიზაცია და ქვეერთეულის ურთიერთქმედებები ახლახან გამოვლენილი ადამიანის შიგნითა კალიუმის არხის Kir2.6. ეს ქვედანაყოფი აღმოაჩინეს, როგორც გენი, რომელიც მუტაციის დროს ანიჭებს მგრძნობელობას TPP-ის მიმართ, მდგომარეობას, რომელსაც ახასიათებს კუნთების სისუსტე ან დამბლა, რომელსაც თან ახლავს ჰიპოკალიემია და თირეოტოქსიკოზი (22). აქ ჩვენ დავახასიათებთ ველური ტიპის Kir2.6-ს, რათა გავიგოთ, თუ როგორ უწყობს ხელს ტიპიური მშობლიური Kir2.6 კუნთების უჯრედების ბიოლოგიაში. გასაკვირია, რომ ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ მიუხედავად იმისა, რომ მისი მიმდევრობა მსგავსია Kir2.x– ის სხვა ქვედანაყოფებთან (㺘% იდენტობაა Kir2.2– თან), Kir2.6 ძალიან ცუდად არის გადატანილი ზედაპირულ მემბრანაზე და ამის ნაცვლად პირველ რიგში ბინადრობს ენდოპლაზმულ ბადეში. Kir2.6-ის მთლიანი უჯრედის დენები თავისთავად ძალიან მცირეა სხვა შიდა გამსწორებელ ქვედანაყოფებთან შედარებით მისი დაბალი ზედაპირის გამოხატვის გამო. თუმცა, შიდა მაკორექტირებელი არხები შედგება ქვედანაყოფების ჰეტეროტეტრამერული შეკრებისგან და ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ Kir2.6 ადვილად ემთხვევა სხვა Kir2.x ქვედანაყოფებს. ტრეფიკინგის დომინანტური ფენოტიპის გამო, Kir2.6 ახორციელებს მნიშვნელოვან მარეგულირებელ კონტროლს შიდა მაკორექტირებელი არხების ტრეფიკინგზე ER– ში დომინანტური ნეგატიური შეკავების გზით. ჩვენი ინფორმაციით, ეს არის პირველი დემონსტრირება, რომელიც არეგულირებს კალიუმის ძლიერი შიდა გამსწორებელი Kir2 არხების ტრეფიკინგის ველური ტიპის არხის ქვედანაყოფებთან დომინანტური უარყოფითი ურთიერთქმედებით.

ჩონჩხის კუნთში კალიუმის არხების ლოკალიზაცია მნიშვნელოვანია მათი ფუნქციონირებისათვის Kir2 არხები მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ უჯრედის დასვენების პოტენციალის ჩამოყალიბებაში, კუნთოვანი უჯრედების აგზნებადობის კონტროლში ნატრიუმის არხის ინაქტივაციის მოცულობის განსაზღვრისას და K +-ის აქტივობაზე დამოკიდებული დაგროვების გაწმენდაში. T- მილაკები. ჩვენ ვაჩვენეთ იმუნოციტოქემიით, რომ ძირითადი ჩონჩხის კუნთის კირ არხები Kir2.1 და Kir2.2 კარგად არის განლაგებული ამ ფუნქციებისთვის, Kir2.1 არხები განლაგებულია პლაზმურ მემბრანაზე და T- ტუბულების პერიფერიულ რეგიონებზე, ხოლო Kir2.2 მდებარეობს. T- ტუბულებისა და ნეირომუსკულური შეერთების ცენტრალურ რეგიონებში (სურ. 6). ეს შედეგები კარგად ეთანხმება შემოთავაზებულ ლოკალიზაციას შიგნითა გამომსწორებელი არხების შესახებ ბაყაყის ჩონჩხის კუნთების ელექტროფიზიოლოგიურ კვლევებზე დაფუძნებული (8, 12,�) და ვირთხების ჩონჩხის კუნთების ბიოქიმიური მემბრანის ფრაქციების კვლევებზე (1). მართლაც, კირ არხის ლოკალიზაციის მყარი შემთხვევა T- მილაკებზე და პლაზმურ მემბრანაზე გაკეთდა Wallinga– ს მიერ და სხვები (15), რომელმაც მოდელირებით აჩვენა, რომ ჩონჩხის კუნთების აგზნებადობისა და აღგზნება-შეკუმშვის დაწყვილება განმეორებითი მოქმედების პოტენციური სროლის დროს მოითხოვს კირ არხების არსებობას ამ უბნებში K + –ის გასასუფთავებლად და დასვენების მემბრანის პოტენციალში პოზიტიური ძვრების თავიდან ასაცილებლად. ჩვენი შედეგები ასევე ემთხვევა გულის კუნთის კვლევებს, რომელშიც ნაჩვენებია T-ტუბულების და პლაზმური მემბრანის ლოკალიზაცია და მათი როლი K + დაგროვებაში (5, 6, 10, 11).

Although Kir2.2 and Kir2.6 share more than 98% identity and are thought to have arisen from gene duplication (22) with several diversifications acquired throughout evolution, their trafficking and localization are widely different. Exogenous expression of Kir2.6 in both COS-1 cells and mouse skeletal muscle showed colocalization with the ER marker PDI, indicating that Kir2.6 is retained in the ER and trafficked poorly to the plasma membrane ( Figs. 1 , ​ ,7, 7 , and ​ and9). 9 ). In contrast Kir2.1 and Kir2.2 trafficked out of the ER through the Golgi, shown by colocalization with Golgi markers, and finally expressed on T-tubules and the plasma membrane ( Figs. 1 , ​ ,7, 7 , and ​ and10 10 and supplemental Fig. S2).

Even though Kir2.6 primarily is retained in the ER, a small proportion of the channel is trafficked to the cell surface in COS-1 cells. We speculated that this surface Kir2.6 formed functional homotetrameric channels. Indeed, electrophysiological investigation confirmed that Kir2.6 can form functional channels on the plasma membrane, in agreement with findings from Ryan და სხვები (22). Kir2.6 currents display characteristic inward rectification, with more pronounced inward currents at potentials negative to than at potentials positive to რა However, when compared with Kir2.2, whole cell currents reveal a marked reduction in magnitude, implying that fewer channels are present on the plasma membrane.

It is possible that high expression levels and longer expression times in some cultured cells may allow Kir2.6 channels to escape cellular trafficking and quality control mechanisms and may account for larger Kir2.6 current magnitudes observed by Ryan და სხვები (22) in 293T cells. In mouse skeletal muscle, however, even after 7� days of expression in vivo, we found no evidence for Kir2.6 trafficking beyond the ER when Kir2.6 was expressed alone, suggesting that it is effectively retained in the ER ( Fig. 7 ). When expressed with Kir2.1 in mouse skeletal muscle, a very low level of Kir2.6 trafficked to the Golgi ( Fig. 9 ). In primate skeletal muscle, it is possible that a tissue-specific and species-specific accessory subunit or chaperone may aid the forward trafficking of Kir2.6 thus, a greater fraction of Kir2.6 might traffic to surface membranes in human skeletal muscle.

Although the Kir2.6 sequence includes all known anterograde trafficking signals that are present in other Kir2.x channels, it is still retained in the ER ( Figs. 1 , ​ ,5, 5 , ​ ,7, 7 , ​ ,9, 9 , and ​ and10). 10 ). Our studies show that a previously unidentified site, proline 156, is the most essential amino acid for surface trafficking of Kir2.2, and notably, the leucine at position 156 of Kir2.6 caused its retention in the ER ( Figs. 3 and ​ and8). 8 ). Alignment of all known human Kir family sequences to identify conserved amino acids shows that the amino acid pair cysteine 155 and proline 156 is conserved among nearly all eukaryotic Kir subunits, but a leucine is present in place of the proline in Kir2.6 ( Fig. 11 ). Prolines have an established role in α-helical turn structure and are commonly found as the first residue of an α-helix (48). Indeed, in the three-dimensional structure of Kir2.2 (Protein Data Bank file 3JYC ), proline 156 is located at a turn that forms the beginning of the M2 inner helix ( Fig. 11 ) (49). Significantly, the adjacent cysteine 155 is part of an intrasubunit disulfide with conserved cysteine 123 that is essential for channel function and that bridges the two extracellular loops in eukaryotic Kir2 channels (49,�). It has been shown that mutation of either of these conserved cysteines of Kir2.1 in one subunit of a channel tetramer is sufficient to eliminate wild type Kir2.1 currents in a dominant negative manner (50). We assume that proline 156 in Kir2.2 induces bending that initiates the M2 helix. Leucine at this position in Kir2.6 likely impacts channel conformation and may alter folding efficiency or disulfide bond formation that could result in retention of Kir2.6 in the ER.

Alignment of Kir2 family reveals a conserved proline located between the P-loop and the M2 helix. , multisequence alignment of human Kir family members was performed with Clustal W (1.81) with Kir sequences from IUPHAR. Leucine 156 in Kir2.6 is instead a conserved proline that initiates the M2 transmembrane helix in nearly all other Kir channels (site is shown in bold text). , two subunits of chicken Kir2.2 (Protein Data Bank code 3JYC ) are shown, with conserved proline 156 and an adjacent disulfide bond between cysteine 155 and cysteine 123 (49).

Interestingly, the absence of a conserved proline has been implicated in a loss of function of two voltage-gated potassium channel subunits. Kv6.3 and Kv8.1 are electrically silent homotetrameric channels because of retention in the ER, a phenomenon likely resulting from divergence of a proline-containing motif. Study of chimeric subunits between Kv6.3 and Kv2.1 and point mutation analysis in Kv8.1 revealed that a PXP motif, located in the S6 transmembrane domain in the gating hinge, is altered to PXT or PXA in the silent channels, respectively (53, 54) (Protein Data Bank file 2A79 ).

We have shown that Kir2.6 associates with Kir2.1 and Kir2.2 by immunoprecipitation ( Fig. 4 ), with important consequences on channel trafficking, plasma membrane abundance, and localization ( Figs. 3 , ​ ,5, 5 , ​ ,9, 9 , and ​ and10). 10 ). Kir2 channels are known to form by homotetrameric and heterotetrameric assembly of Kir2.x subunits, with the resulting channels reflecting the physiological properties of their subunits (3). However, the subunit composition, the extent of heteromultimerization, and the roles of individual subunits in different cell types are not known. Gene knock-out studies in mice showed that Kir2.1 and Kir2.2 contribute to K + currents in heart in a nonadditive manner, suggesting that these subunits can coassemble in vivo (21). In cardiac myocytes, the diversity of channel conductances, Ba 2+ block properties, and pH sensitivity also support a model in which channels are composed of homotetrameric and heterotetrameric subunits (33,�). Our data showing the overlapping distribution of endogenous Kir2.1 and Kir2.2 channels in skeletal muscle T-tubules are consistent with the idea that a fraction of these subunits coassemble in vivo in skeletal muscle ( Fig. 6 ).

Our trafficking studies, in which Kir2.6 causes ER retention of other Kir2.x subunits and colocalization of subunits, provide strong support for heteromultimeric formation of Kir2 channels in skeletal muscle, cardiac muscle cells, and COS-1 cells ( Figs. 3 , ​ ,5, 5 , ​ ,9, 9 , and ​ and10). 10 ). Kir2.6 is the dominant subunit when it forms a heteromultimer with Kir2.1 or Kir2.2 in vivo and has a stronger dominant negative trafficking effect on Kir2.2 compared with Kir2.1, suggesting that those subunits that are most similar in sequence may have a greater propensity to coassemble. A dominant negative trafficking phenomenon also is a well known explanation for disease-associated mutations in Andersen-Tawil syndrome where Kir2.1 𹒕� and Kir2.1 �� do not traffic to the plasma membrane. Instead, they are distributed inside the cell, although they retain their ability to coassemble with wild type channels (18). Bendahhou და სხვები (18) speculate that deletion of amino acids 95�, located in the outer M1 helix, results in protein misfolding and consequent ER retention. Coexpression of wild type Kir2.1 with Kir2.1 𹒕� or Kir2.1 �� trapped the wild type subunit at intracellular sites. Reduction in Kir2.1 expression on the plasma membrane can interfere with regulation of electrical excitability and muscle resting potential (18).

It is interesting to note that another gene encoding Kir2.5/Kir2.2v, also closely related to Kir2.2, may act as a negative regulator of Kir2.2 channel activity as well, but in that case the Kir2.5 subunit is electrically silent possibly because of alterations of the conserved GYG selectivity filter or C terminus (55).

Although our studies do not address the function of Kir2.6 mutations that are associated with TPP, we speculate that some of those mutations may alter channel trafficking, leading to changes in the magnitude of Kir2 currents on surface membrane and T-tubules. Two of the TPP-associated mutations, Kir2.6 R399X and Kir2.6 Q407X, cause truncation of the Kir2.6 C terminus and result in the absence of a putative PDZ-binding motif (22), a region known to be important for subcellular localization of Kir2 channels (7, 10, 11, 28, 30, 31).

The Kir2.6 gene contains a thyroid-responsive element that may regulate gene transcription (22) and consequently lead to changes in its protein abundance, ER retention of Kir2.x subunits, and reduction in inward rectifier currents. Thus, thyrotoxicity may alter a delicate balance of electrical activity in muscle. Modeling studies and human disease-associated mutations in the genes encoding Kir2.1 and Kir2.6 suggest that too little or too much inward rectifier current can alter the electrical excitability of muscle and lead to paralysis (15, 17, 22, 56). Because TPP patients normalize when treated with antithyroid agents (reviewed in Ref. 57), the consequences of high T3 on muscle conductance is of interest.

In summary, we suggest that Kir2.6 is a regulatory subunit that is mainly retained in the ER as a consequence of leucine 156. Association between Kir2.6 and Kir2.1 or Kir2.2 promotes ER retention of the heterotetramer. The amount of inward rectifier channels on the plasma membrane may depend on the ratio between the Kir2.1, Kir2.2, and Kir2.6 subunits. We speculate that homeostasis is maintained in healthy individuals, enabling a stable amount of cell surface channel expression. Together, our data support the concept that ER retention is an important mechanism in controlling skeletal muscle excitability.