ინფორმაცია

არის კომერციულად ხელმისაწვდომი ნაკადის ციტომეტრიული ანალიზის პროგრამული უზრუნველყოფის ალტერნატივა უჯრედული ციკლის ანალიზში გამოსაყენებლად?

არის კომერციულად ხელმისაწვდომი ნაკადის ციტომეტრიული ანალიზის პროგრამული უზრუნველყოფის ალტერნატივა უჯრედული ციკლის ანალიზში გამოსაყენებლად?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

მე ვიცი, რომ ბევრი ლაბორატორია იყენებს FlowJo-ს ან FCS Express-ს მათი ნაკადის მონაცემების დასაგეგმად და გასაანალიზებლად. როგორც ჩანს, ეს ორი სტანდარტია ლაბორატორიების უმეტესობისთვის (და მე ადრე გამოვიყენე FlowJo). თუმცა, ჩემი ამჟამინდელი დაფინანსება არ მოიცავს პროგრამული უზრუნველყოფის ლიცენზიებს და მე არ მსურს გადავიხადო 500-2000 დოლარი ჯიბიდან ლიცენზიისთვის.

არის თუ არა ალტერნატივები, რომლებიც უახლოვდება FlowJo/FCS Express-ის ხარისხს, მაგრამ არის ღია/უფასო აკადემიური ლიცენზიით? მე ვეძებ მიდგომას, რომელიც საშუალებას მომცემს მოვარგო G1/S/G2-M მრუდები ჩემს მონაცემებს.


როგორც ჩანს, თქვენ უნდა შეხედოთ Bioconductor-ის ნაკადის კომპლექტს. მე ნამდვილად მომწონს ნაკადის ანალიზის გაკეთება R-ში, მაგრამ ამას გარკვეული პრაქტიკა და შეჩვევა სჭირდება.

ყველაზე დიდი პრობლემა, რომელსაც წააწყდებით (ჩემი აზრით) არის კარიბჭე. ადვილი არ არის GUI წერტილის დაყენება და კარიბჭის დაწკაპუნება. პირიქით, თქვენ უფრო იძულებული იქნებით და მიდრეკილნი იქნებით დააყენოთ ლიმიტები ალგორითმებით ან მყარი მნიშვნელობის ლიმიტებით.

მივხვდი, რომ .Net Bio სახალისოა, მაგრამ არც ისე ძლიერი, როგორც Bioconductor.

მეტა შენიშვნა, ვერ მოვიფიქრე ნაკლებად აზრზე ორიენტირებული გზა პასუხის გასაცემად, გარდა იმისა, რომ ვთქვა "ეს შეიძლება გაკეთდეს R-ში ბიოგამტარის გამოყენებით." თუ ეს ჯერ კიდევ გამორთულია, მე კარგად ვარ წაშლით.


მე შევქმენი უფასო ნაკადის ციტომეტრიის ინსტრუმენტი, რომელიც მუშაობს ნებისმიერ მოწყობილობაზე https://www.redmatterapp.com/

ამ ხელსაწყოს უპირატესობები ისაა, რომ ის მუშაობს ნებისმიერ მოწყობილობაზე და ანალიზის გაზიარება შესაძლებელია URL-ის საშუალებით.


ცოცხალ უჯრედებში დნმ-ის შემცველობის გაზომვა ფლუორესცენტული მიკროსკოპით

ცოცხალი უჯრედის ფლუორესცენტული მიკროსკოპია (LCFM) არის ძლიერი ინსტრუმენტი, რომელიც გამოიყენება რეალურ დროში ფიჭური დინამიკის გამოსაკვლევად. თუმცა, უნარი ერთდროულად გაზომოს დნმ-ის შემცველობა უჯრედებში, რომლებსაც დროთა განმავლობაში თვალყურს ადევნებთ, საღებავებთან ასოცირებული ტოქსიკურობით რჩება გამოწვევა. ცალკეულ უჯრედებში დნმ-ის შემცველობის გაზომვის უნარი LCFM-ის საშუალებით საშუალებას მისცემს უჯრედულ სტადიას და პლოიდიას დაერთოს სხვადასხვა გამოსახულების მიმართულ ანალიზებთან. აქ ჩვენ აღვწერთ ფართოდ გამოყენებად არატოქსიკურ მიდგომას ცოცხალ უჯრედებში დნმ-ის შემცველობის გასაზომად ფლუორესცენტული მიკროსკოპით. ეს მეთოდი ეყრდნობა ცოცხალი უჯრედის მემბრანის გამტარი დნმ ფტორფორის შეყვანას, როგორიცაა Hoechst 33342, უჯრედების კულტურის გარემოში ნებისმიერი ცოცხალი უჯრედის გამოსახულების ექსპერიმენტის დასასრულს და თითოეული უჯრედის ინტეგრირებული ბირთვული ფლუორესცენციის გაზომვას დნმ-ის შემცველობის რაოდენობრივი დასადგენად. მნიშვნელოვანია, რომ ჩვენი მეთოდი გადალახავს დნმ-ის დაზიანების ტოქსიკურობას და ინდუქციას, რომელიც ჩვეულებრივ გამოწვეულია ცოცხალი უჯრედების საღებავებით, კულტურებში საღებავის დამატების სტრატეგიული ვადების მეშვეობით, რაც საშუალებას აძლევს შეუფერხებელ უჯრედებს გადაიტანონ გამოსახულება დროის ნებისმიერი ინტერვალით, სანამ დნმ-ის შემცველობის რაოდენობრივ გაზომვას შეძლებენ. ჩვენ ვაფასებთ ჩვენი მეთოდის ეფექტურობას ემპირიულად და განვიხილავთ ადაპტაციებს, რომლებიც შეიძლება განხორციელდეს ამ ტექნიკის გამოყენებით.

შედეგები

წარმოდგენილია უჯრედებთან ერთად, რომლებიც გამოხატავენ ჰისტონ 2B-GFP შერწყმა პროტეინს (H2B-GFP), ჩვენ ვაჩვენეთ, თუ როგორ აძლევდა ამ მეთოდს საშუალებას ქრომოსომული სეგრეგაციის შეცდომების თვალყურის დევნება უჯრედებში, როდესაც ისინი პროგრესირებდნენ უჯრედული დაყოფის გზით, რომლებიც მოგვიანებით იდენტიფიცირებულ იქნა როგორც დიპლოიდური ან პოლიპლოიდური. ჩვენ ასევე აღვწერთ და გთავაზობთ Matlab-ის ავტომატიზირებულ ალგორითმს, რომელიც ზომავს ინტეგრირებულ ბირთვულ ფლუორესცენციას თითოეულ უჯრედში და შემდგომში ასახავს ამ გაზომვებს უჯრედის ციკლის ჰისტოგრამაში თითოეული გამოსახული ჩარჩოსთვის. დნმ-ის შემცველობის ალგორითმის ზუსტი შეფასება დადასტურდა პარალელური ნაკადის ციტომეტრიული კვლევებით.

დასკვნები

ეს მეთოდი საშუალებას იძლევა ერთუჯრედიანი დინამიკის შესწავლა იყოს დაკავშირებული უჯრედულ სტადიასთან და პლოიდიასთან მაღალი გამტარუნარიანობით. მიდგომა შესაფერისია ნებისმიერი სტანდარტული ეპიფლუორესცენციის მიკროსკოპისთვის, რომელიც აღჭურვილია სტაბილური განათების წყაროთი და ან საფეხურის ზედა ინკუბატორით ან დახურული ცოცხალი უჯრედების ინკუბაციური კამერით. ერთობლივად, ჩვენ მოველით, რომ ეს მეთოდი საშუალებას მისცემს უჯრედული პროცესების მაღალი გარჩევადობის მიკროსკოპულ ანალიზს, რომელიც მოიცავს უჯრედული ციკლის პროგრესირებას, როგორიცაა გამშვები პუნქტის გააქტიურება, დნმ-ის რეპლიკაცია და უჯრედული დაყოფა.


შესავალი

ტრანსფექცია არის ერთ-ერთი ყველაზე ხშირად გამოყენებული ტექნიკა მოლეკულურ ბიოლოგიაში [1, 2]. ტრანსფექცია არის პლაზმური ნუკლეინის მჟავის (დნმ, რომელიც ატარებს საინტერესო გენს ან mRNA) სამიზნე უჯრედებში შეყვანის პროცესს, რომლებიც საბოლოოდ გამოხატავენ სასურველ ნუკლეინის მჟავას ან ცილას. არსებობს უჯრედებში ნუკლეინის მჟავების შეყვანის მთელი რიგი სტრატეგიები, რომლებიც იყენებენ სხვადასხვა ბიოლოგიურ, ქიმიურ და ფიზიკურ მეთოდებს [1–3]. თუმცა, არსებობს ფართო ცვალებადობა ტრანსფექციის ეფექტურობასთან, უჯრედის ტოქსიკურობასთან, გენის ექსპრესიის დონესთან და ა.შ. იმის დასადგენად, თუ როგორ მოქმედებს ეს ფაქტორები ტრანსფექციაზე, საჭიროა მგრძნობიარე და მძლავრი გამოვლენის ანალიზი ტრანსფექციის სხვადასხვა მეთოდების ეფექტურობის რაოდენობრივი და ოპტიმიზაციისთვის. სამიზნე გენის ციტოზოლში მიწოდება და ცილის გამოხატვის ხელშეწყობა უჯრედების ტოქსიკურობის შემცირებისას.

მკვლევარები ხშირად იყენებენ ადვილად გადასატანი რეპორტიორის ანალიზებს ტრანსფექციის ეფექტურობისა და მათი ქვედა დინებაში გამოყენების დასადგენად [1, 2]. ხშირად გამოყენებული რეპორტიორები მოიცავს ციცინათელას ან რენილა ლუციფერაზას და მწვანე ფლუორესცენტურ ცილას (GFP). ლუციფერაზას ანალიზი მგრძნობიარეა და შესაფერისია ნიმუშებს შორის ტრანსფექციის შედარებითი ეფექტურობის დასადგენად, მაგრამ აქვს რამდენიმე შეზღუდვა, რადგან ის მოითხოვს უჯრედების ლიზას და არ განსაზღვრავს ტრანსფექციის მეთოდის უჯრედების ტოქსიკურობას [4]. უჯრედები, რომლებიც გამოხატავენ GFP-ის რეპორტიორს, შეიძლება ვიზუალიზაცია მოხდეს უშუალოდ ფლუორესცენციული მიკროსკოპით, რომელიც შეიძლება იყოს სუბიექტური და შრომატევადი [5]. ნაკადის ციტომეტრია არის შესანიშნავი/ხელოვნების დონე რაოდენობრივი ფენოტიპისთვის მაღალი მგრძნობელობის მქონე უჯრედების დიდ პოპულაციაში, შეიძლება გაერთიანდეს უჯრედების დახარისხებასთან ქვედა დინებაში გამოყენებისთვის [6] და წარმოადგენს ყველაზე ზუსტ და ობიექტურ მეთოდს ტრანსფექციის ეფექტურობის დასადგენად [6] , ინდუქციური რეპორტიორების გამოხატვის მონიტორინგი [7] და სამიზნე ცილების დროზე დამოკიდებული დეგრადაციის გამოვლენა [8]. უჯრედებში ტრანსფექციის ეფექტურობის რაოდენობრივი განსაზღვრის უახლესი ნაკადის ციტომეტრიული მეთოდები ეფუძნება GFP-შერწყმის ცილების ტრანსფექციას ან GFP პლაზმიდების თანატრანსფექციას. ორივე სტრატეგიას აქვს თავისი შეზღუდვები, მათ შორის კონკურენცია ორი განსხვავებული პლაზმიდის გამოხატვაში, რამაც შეიძლება ზიანი მიაყენოს დაინტერესებული პლაზმიდის ტრანსფექციის ეფექტურობას [9, 10], პლაზმიდების არათანაბარი მიწოდება უჯრედებს შორის, რამაც შეიძლება გავლენა მოახდინოს მომხსენებლის გამოხატვის წრფივობაზე [6, 9-11] არათანმიმდევრული ტრანსფექცია, რომელიც დაფუძნებულია მომხსენებელი პლაზმიდის ტიპზე, რომელსაც შეუძლია მნიშვნელოვანი ექსპერიმენტული მიკერძოება მოახდინოს ტრანსფექციის ეფექტურობის შეფასებაში [12, 13] და უჯრედების ან ქსოვილების დამუშავებისას GFP ფლუორესცენციის არტეფაქტებს [14, 15]. რაც მთავარია, ჩვენ არ ვიცით ურთიერთქმედების ზუსტი ბუნება სხვადასხვა თანატრანსფექციულ რეპორტიორ გენებს შორის, რაც იწვევს მათ აქტივობებში ცვალებადობას [12, 13].

ფლუორესცენტური რეპორტიორი გენების გამოყენების ალტერნატიული და უფრო პირდაპირი მეთოდია ნუკლეინის მჟავების პირდაპირ მარკირება ფლუორესცენტური საღებავებით, რათა თვალყური ადევნოთ მათ უჯრედშიდა მიწოდებას [16]. არარადიოაქტიური ფერმენტული მარკირების მეთოდები არსებითად რთულია კონტროლირებადი და ეტიკეტირებული პროდუქტების გენერირება, რომლებიც არ წარმოადგენენ საწყისი დნმ-ს [17]. არაფერმენტული Label IT ® Tracker TM ნაკრების გამოყენებით, ნებისმიერი პლაზმიდი შეიძლება იყოს მორგებული ეტიკეტირებული მარტივი ერთსაფეხურიანი ქიმიური რეაქციის სახით ძუძუმწოვრების უჯრედებში შეყვანამდე [18]. ამრიგად, ეტიკეტირებული დნმ-ის სუბუჯრედული ლოკალიზაცია და ექსპრესიის მომხსენებელი ტრანსგენის ერთდროულად მონიტორინგი შესაძლებელია ძუძუმწოვრების უჯრედებში ეტიკეტირებული პლაზმიდის შეყვანის შემდეგ [16, 18]. ეს მეთოდი ადრე გამოიყენებოდა იმუნოფლუორესცენციის ექსპერიმენტებისთვის, თუმცა, როგორც ზემოთ აღინიშნა, ეს მიდგომა შეიძლება იყოს სუბიექტური, ხარისხობრივი და შრომატევადი [5, 16, 18].

აქ ჩვენ ვაჩვენებთ ნაკადის ციტომეტრული ანალიზის შემუშავებას ტრანსფექციის ეფექტურობის დასადგენად რეპორტიორის პლაზმიდის მარკირებით Label IT ® TrackerTM. ეს მეთოდი არ არის დამოკიდებული ორი სხვადასხვა პლაზმიდის თანატრანსფექციაზე და ერთდროულად აფასებს უჯრედის სიკვდილს, ეტიკეტირებული პლაზმიდის ათვისებას გარდამავალი ტრანსფექციის დროს და სამიზნე ცილის ექსპრესიას. ჩვენ ვაჩვენეთ, რომ ეს მეთოდი შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც ინსტრუმენტი i) ტრანსფექციის ეფექტურობის ოპტიმიზაციისთვის სტანდარტულ უჯრედულ ხაზში, ii) უჯრედული ტოქსიკურობის რაოდენობრივად განსაზღვრა სხვადასხვა ტრანსფექციის მეთოდების, iii) დნმ-ის შეწოვის დასადგენად ძნელად ტრანსფექტირებულ უჯრედებში ელექტროპორაციის გზით. გამოიყენეთ GFP პლაზმიდის თანატრანსფექცია, რომელსაც შეუძლია კიდევ უფრო შეამციროს ტრანსფექციის ეფექტურობა. ეს ნაკადის ციტომეტრიული მეთოდი შეიძლება პირდაპირ იქნას გამოყენებული ტრანსფექციის რამდენიმე მეთოდის ოპტიმიზაციისთვის, მათ შორის გენური თერაპიის სტრატეგიების (მაგ. CRISPR/Cas სისტემა).


1 შესავალი

მეცხრამეტე საუკუნის ბოლო მეოთხედში დაწყებულმა კვლევებმა თანდათან გამოავლინა ქრომოსომების ძირითადი როლი მემკვიდრეობითი ინფორმაციის შესანახად და გადაცემაში და გენეტიკური ვარიაციების წარმოქმნაში. ქრომოსომის ორგანიზაციისა და ქცევის შესწავლის ყველაზე გავრცელებული მეთოდი იყო ოპტიკური მიკროსკოპია. თუმცა, მეოცე საუკუნის ბოლო მეოთხედში, მცდელობები იქნა გამოყენებული ნაკადის ციტომეტრია ადამიანის ქრომოსომის კომპლემენტის სწრაფი და რაოდენობრივი დახასიათებისთვის (ნაკადის კარიოტიპინგი), რათა ჩაენაცვლებინა შრომატევადი მიკროსკოპული დაკვირვება [1, 2]. სამწუხაროდ, ეს მოლოდინი არ გამართლდა. ამის ნაცვლად, შეიქმნა მოლეკულური ციტოგენეტიკა და უზრუნველყო ბევრად უფრო მაღალი გარჩევადობა და უფრო დეტალური ინფორმაცია ადამიანის, ცხოველისა და მცენარის ქრომოსომების მოლეკულურ ორგანიზაციასთან დაკავშირებით. მიუხედავად იმისა, რომ ნაკადის კარიოტიპირება ვერ გაუწევს კონკურენციას მოლეკულურ ციტოგენეტიკას, სამართლიანია აღვნიშნოთ რამდენიმე გამონაკლისი, როგორიცაა ხორბლის ჯიშების ანალიზი, სადაც მან აღმოაჩინა რეკომბინირებული ქრომოსომები, რომელთა არსებობა ადრე უცნობი იყო [3].

ნაკადის ციტომეტრიული ქრომოსომის ანალიზის მეთოდების ხელმისაწვდომობამ ასევე გახსნა გზები კონკრეტული ქრომოსომების გამწმენდი ნაკადის დახარისხების გზით. საინტერესოა, რომ ამ მეთოდმა ხელი შეუწყო ქრომოსომის შეღებვის განვითარებას [4, 5], რომელმაც რევოლუცია მოახდინა ძუძუმწოვრების ციტოგენეტიკაში. ქრომოსომების დახარისხებამ ასევე მნიშვნელოვანი როლი ითამაშა ადამიანის გენომის თანმიმდევრობის პროექტის დასაწყისში გენების ქრომოსომებთან რუკების გაადვილების გზით და ქრომოსომისთვის სპეციფიკური დნმ ბიბლიოთეკების განვითარების გზით [6, 7]. მცენარეებში, ქრომოსომის დახარისხება გამოყენებულია მრავალ გამოყენებაში, დაწყებული დნმ მარკერების მიზანმიმართული განვითარებისგან [8-11], დნმ ბიბლიოთეკების აგებით [12, 13], გენების კლონირებით [14, 15], გენომის თანმიმდევრობით [16- 18] და მთელი გენომის თოფის თანმიმდევრობის შეკრებების ვალიდაცია [19, 20].

მთელ გენომთან შედარებით, ქრომოსომის დახარისხება გთავაზობთ დნმ-ის ნიმუშის სირთულის მასიურ და უზარმაზარ შემცირებას და ეს ამარტივებს დნმ-ის თანმიმდევრობის მონაცემების ანალიზს და ამცირებს პროექტის ხარჯებს. თუმცა, არსებობს აპლიკაციების დამატებითი ჯგუფი, სადაც სასარგებლოა ქრომოსომის ყველა ქრომოსომის დახარისხება. ვინაიდან გაწმენდილი ნიმუში შედგება მხოლოდ მიტოზური ქრომოსომებისგან, ეს იძლევა შესაძლებლობას დაახასიათოს მიტოზური მეტაფაზის ქრომოსომების პროტეომი და გამოავლინოს ქრომოსომული დნმ-ის სივრცითი ორგანიზაცია ქრომოსომის კონფორმაციის დაჭერის მეთოდების გამოყენებით. შემდეგში ჩვენ აღვწერთ ქრომოსომის ანალიზს და დახარისხებას მაღალ მცენარეებში, მიგვითითებს კრიტიკულ ნაბიჯებზე და გამოვყოფთ მეთოდებს შერჩეული აპლიკაციებისთვის.


დისკუსია

ამ მეთოდურ ნაშრომში წარმოგიდგენთ რამდენიმე მიდგომას ნაკადის ციტომეტრიის შეზღუდვების დასაძლევად ვეტერინარული სახეობების ანალიზში. სწავლის პერიოდში რამდენიმე ტექნიკურ პრობლემას წავაწყდით. მაგალითად, გარკვეული ანტისხეულების კლონი არ იყო საკმარისად მარკირებული პირდაპირი კოვალენტური მარკირების ნაკრებით. ეს ძველი პრობლემაა და მარკირების წინააღმდეგობის ცნობილ მიზეზებს მიეკუთვნება: ბუფერული კომპონენტები რეაგირებენ საღებავთან, სუოპტიმალური pH ან რეაქტიული ამინების ჯგუფები ანტისხეულების ანტიგენთან დამაკავშირებელ ადგილზეა [46]. ზენონის ანტისხეულები შეიძლება იყოს გამოსავალი მონოკლონური IgG ანტისხეულების მარკირებისთვის, რომლებიც კარგად არ იწერება მარკირების კომპლექტებით. მაგალითად, ჩვენი ცხვრის CD4 მონოკლონური ანტისხეული (44.38) არ აძლევდა დამაკმაყოფილებელ შეღებვის ხარისხს, როდესაც კონიუგირებული იყო Invitrogen Pacific Blue ანტისხეულების მარკირების კომპლექტთან. თუმცა, ზენონის ტექნოლოგიის გამოყენებამ უმაღლესი შედეგი გამოიღო. კიდევ ერთი გავრცელებული სირთულეა IgM ანტისხეულების კონიუგაცია, რადგან ეტიკეტირების კომპლექტების უმეტესობა ზრდის pH-ს და დენატურებს IgM-ის ხუთმერულ სტრუქტურას [47]. ზოგიერთი მწარმოებელი, როგორიცაა Thermo Fisher Scientific, გთავაზობთ სპეციფიკურ პროტოკოლებს, რომლებიც ოპტიმიზებულია IgM მარკირებისთვის. (თაგვის IgG1) ანტი-NKp46 კლონის შემთხვევაში, არც კოვალენტური კონიუგაცია და არც Zenon™ ტექნოლოგია არ იყო ეტიკეტირების ეფექტური მეთოდები და ჩვენ უნდა გამოგვეყენებინა შეღებვის მეთოდი, რომელიც მოცემულია ნახ. 4a-ში. სამწუხაროდ, ანტისხეულების ყველა კომერციულ მომწოდებელს არ აქვს თანმიმდევრული ხარისხის კონტროლი და ჩვენ ზოგჯერ ვნახეთ კომერციულად მარკირებული ანტისხეულები, რომლებიც არასანდოა. ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ ერთ შემთხვევაში Zenon™ ნარევმა ხელი შეუშალა სხვადასხვა ანტისხეულების შეღებვას იმავე შეღებვის პანელში. კონკრეტულად, ანტი-ღორის B უჯრედის ანტისხეული (2-104) არის თაგვის IgM და მისი გამოვლენა თაგვის საწინააღმდეგო IgM მეორადი ანტისხეულის მიერ იყო ბუნდოვანი. ELISA-მ გამოავლინა, რომ Zenon™-ის ბლოკირების რეაგენტი, რომელიც შედის კომპლექტებში, შეიცავდა როგორც თაგვის IgG-ს, ასევე თაგვის IgM-ს, და ეს უკანასკნელი კონკურენციას უწევდა ჩვენი თაგვის IgM პირველად ანტისხეულს მეორადი თაგვის საწინააღმდეგო IgM ანტისხეულთან შეკავშირებისთვის. ჩვენ გადავწყვიტეთ პრობლემა დაბლოკვისთვის გაწმენდილი IgG-ის გამოყენებით და არა Zenon™ ნაკრების დაბლოკვის კომპონენტის გამოყენებით.

ზოგიერთი ტანდემური საღებავი მგრძნობიარეა დეგრადაციის მიმართ, რაც იწვევს სუსტ სიგნალს და გამოვლენას სხვა ფტოროქრომულ არხებში. მაგალითად, PE-ტანდემის საღებავები ექვემდებარება დეგრადაციას დამუშავების, შენახვისა და შუქით [48, 49]. ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ ტანდემური საღებავი PE-Cy7, მგრძნობიარეა გაფართოებული ფიქსაციის მიმართ PFA-სთან, რამაც შეიძლება გააფუჭოს ფტორფორი და გამოიწვიოს არტეფაქტური ძლიერი სიგნალები PE არხში. ჩვენ აღმოვაჩინეთ, რომ შემდეგი სიფრთხილის ზომები ხელს უშლის ტანდემური კონიუგატის დეგრადაციას: შეღებვა სიბნელეში 4 °C-ზე, ფრთხილად და ვრცელი რეცხვა ფიქსაციის შემდეგ (ანუ ორჯერ საკმარისი ბუფერული მოცულობით) და შენახვა სიბნელეში 4 °C-ზე არა უმეტეს 24 საათის განმავლობაში. . კიდევ ერთი პოტენციური საკითხი, რომელიც ჩვენს კვლევებში არ შეგვხვედრია, არის Brilliant Violet-ის და სხვა ულტრა კაშკაშა ანტისხეულების ერთმანეთში ჩარევა იმავე პანელში გამოყენებისას. ასეთი პრობლემების მოგვარება შესაძლებელია სპეციალური შეღებვის ბუფერების გამოყენებით. მაგალითად, BD Bioscience გთავაზობთ სპეციფიკურ ბუფერს Brilliant™ საღებავებით შეღებვისთვის [50].

მიუხედავად იმისა, რომ ჩვენ წარმოგიდგენთ რამდენიმე მარტივ მიდგომას უჯრედებზე ნაკადის ციტომეტრიული პარამეტრების რაოდენობის გასაფართოებლად, არსებობს დამატებითი მიდგომები, რომლებიც აქამდე არ გამოგვიყენებია. მაგალითად, PrimeFlow™ (Invitrogen™) ან განშტოებული დნმ-ის მეთოდი არის ტექნიკა, რათა აღმოაჩინოს უჯრედში გამოხატული რნმ ნაკადის ციტომეტრიით [51] და ასევე ხელმისაწვდომია ანტისხეულების მორგებული წარმოება ან მორგებული ანტისხეულების მარკირება.


შესავალი

ნიადაგის პროკარიოტების საზოგადოებები წარმოადგენენ მიკრობულ კრებულებს მაღალი მრავალფეროვნებით Zhou et al., 2002, Curtis et al., 2002, ფართო ფიზიოლოგიური ჰეტეროგენულობა მცირე სივრცულ მასშტაბებში Gaillard et al., 1999, Korsaeth et al., 2001 და მოქმედებს როგორც მედიატორი. ელემენტარული ველოსიპედის, მიწისზედა პროდუქტიულობის და მთლიანი ნიადაგის ჯანმრთელობის შესახებ (ვანბრუგენი და სემენოვი, 2000). ნიადაგის თანამედროვე კვლევა ფოკუსირებულია ისეთ ტექნიკაზე, როგორიცაა 16S rDNA-ზე დაფუძნებული მოლეკულური ტექნიკის გამოყენება საზოგადოების სტრუქტურისა და მრავალფეროვნების შესასწავლად (Oɽonnell and Goerres, 1999). თუმცა, თანაბრად მნიშვნელოვანია მიკრობების კლასიფიკაცია მათი ფიზიოლოგიიდან გამომდინარე, ანუ მიკრობების, რომლებიც ფუნქციურად აქტიურია ნიადაგის ეკოსისტემაში, წინააღმდეგ შემთხვევაში, რომლებიც ეფექტურად ჭარბობენ და არ თამაშობენ მცირე როლს კონკრეტულ დროს. იმისათვის, რომ გავიგოთ ნიადაგის ეკოლოგიაში ფუნქციონალურობისა და სიჭარბის ცნებები და როგორ უკავშირდება ისინი ნიადაგის პროცესებს, ნიმუშის ფარგლებში აქტიური მრავალფეროვნების დადგენა უნდა იყოს მთავარი მოთხოვნა.

ნიმუშის ფარგლებში აქტიური მრავალფეროვნების შეფასებას აქვს გამოყენების ფართო სპექტრი მიკრობული ეკოლოგიის მთელ სფეროში. კულტურაზე დაფუძნებული მეთოდების არაადეკვატურობის გაცნობიერებამ ბუნებრივი მრავალფეროვნებისა და მისი აქტიური კომპონენტების წარმოჩენისთვის (Head et al., 1998) განაპირობა ერთუჯრედიანი „აქტივობის“ ზომების მიღება. ტექნიკა, როგორიცაა ციტოქიმიური მარკირება არაფლუორესცენტური (Thom et al., 1993) ან ფლუორესცენტური რედოქს საღებავებით (Schaule et al., 1993), მემბრანული პოტენციური ლაქები (Lopez et al., 1995), ნუკლეინის მჟავის შემცველობა (Lebaron et al. , 2001 ა) და ერთუჯრედოვანი ავტორადიოგრაფია Andreasen and Nielsen Per, 1997, Gray et al., 2000, ყველა საშუალებას აძლევს ფიჭური აქტივობის ოპერაციულ განსაზღვრებას. ტრადიციულად, მიკროსკოპია გამოიყენებოდა როგორც გამოვლენის საშუალება (Whiteley et al., 1996), მაგრამ მიკრობული ნაკადის ციტომეტრიის გამოყენება (Steen, 2000) იძლევა ფიზიოლოგიური ჰეტეროგენურობის ანალიზის სიჩქარით და სიზუსტით რთული ბიოლოგიური პოპულაციებისთვის. გარდა ამისა, ერთუჯრედიანი ნაკადის დახარისხების გამოყენება საშუალებას იძლევა განსაზღვრული პოპულაციის აღდგენა სხვა ანალიზებისთვის, როგორიცაა ეტიკეტირებული წინამორბედების ინკორპორაციის კვლევები (Lebaron et al., 2001a) და/ან მოლეკულური მრავალფეროვნების დახასიათება (Bernard et al., 2000). შესაბამისად, ამ ტექნიკის კომბინაციამ მნიშვნელოვნად გააუმჯობესა ჩვენი გაგება უჯრედული აქტივობისა და ფუნქციონირების შესახებ მიკრობული ეკოლოგიის ბევრ სფეროში Servais et al., 1999, Servais et al., 2001, Bernard et al., 2000, Lebaron et al., 2001b. .

ნიადაგის მიკრობული ეკოლოგიისთვის ნაკადის ციტომეტრიისა და უჯრედების დახარისხების ერთ-ერთი მნიშვნელოვანი ნაკლი არის ნიადაგის მატრიცის სირთულე. კერძოდ, ნაკადის ციტომეტრიული ანალიზები ეფუძნება ცალკეული უჯრედების შეჩერებას, ხოლო ნიადაგის მატრიცა შედგება ბაქტერიების ბიოფილმებისგან, რომლებიც მჭიდროდ არის დაკავშირებული ჰაბიტატის ფიზიკურ სტრუქტურებთან. თუმცა, სიმკვრივის გრადიენტური ცენტრიფუგაციის გამოყენება ისეთი საშუალებების გამოყენებით, როგორიცაა Nycodenz (მაგ. Lindahl and Bakken, 1995) ნიადაგის ბაქტერიების თხევად სუსპენზიებად გასაწმენდად, შეიძლება დაუშვას ციტომეტრული ტექნიკის განხორციელება ნიადაგის თემებზე. ბოლო დროს, ნიადაგიდან გრადიენტური გაწმენდით მიღებული უჯრედული სუსპენზია ნაჩვენებია, რომ წარმოადგენენ თავდაპირველ საზოგადოებას (Katayama et al., 1998), მინიმალური ზემოქმედებით უჯრედის მთლიანობაზე ან ფიზიოლოგიაზე Lindahl and Bakken, 1995, Lindahl, 1996, Mayr et al. , 1999, თუმცა ძალიან მგრძნობიარე ნიადაგის ტაქსონებისთვის, როგორიცაა მეთანის ოქსიდიზატორები (Prieme et al., 1996).

ნიადაგის პროკარიოტული თემების აქტიური კომპონენტის ოპერატიულად განსაზღვრის მიზნით, ჩვენ ვცდილობდით უჯრედების გაწმენდის სტრატეგიების დაკავშირებას ნაკადის ციტომეტრიით. ამ მიზნით, ჩვენ გამოვიყენეთ Nycodenz-ით გაწმენდილი უჯრედის სუსპენზია ნიადაგებიდან, შეღებილი ნუკლეინის მჟავით ან რედოქს მგრძნობიარე ფტოროქრომებით, უჯრედების მთლიანი რაოდენობისა და აქტიური კომპონენტის გასაზომად. ჩვენ ვაჩვენებთ ანალიზის მეთოდის ეფექტურობას ნიადაგის თემების ექსპერიმენტული მანიპულირების დროს და ნიმუშებიდან აქტიური უჯრედების ნაკადის დახარისხებას მრავალფეროვნების შემდგომი 16S rDNA-ზე დაფუძნებული ანალიზებისთვის.


შესავალი

უჯრედები ათავისუფლებენ 50-1000 ნმ ბუშტუკებს თავის გარემოში პლაზმური მემბრანიდან პირდაპირი გამოყოფით ან ეგზოსომების სახით გვიანი ენდოსომური ნაწილების (მულტისიკულარული სხეულების) შერწყმის შედეგად პლაზმურ მემბრანასთან 1,2. ასეთი უჯრედებიდან მიღებული ვეზიკულები შეიძლება გამოვლინდეს როგორც უჯრედული კულტურის პირობებში, ასევე სხეულის სხვადასხვა სითხეებში, სადაც ისინი შეიძლება იმოქმედონ როგორც უჯრედშორისი კომუნიკაციის სატრანსპორტო საშუალება 1,2. უჯრედებიდან მიღებული ვეზიკულების სხვადასხვა მახასიათებლები აღწერილია სხვადასხვა კვლევითი ჯგუფის მიერ, ეს დამოკიდებულია ვეზიკულების წყაროსა და გამოყენებული იზოლაციის პროცედურაზე 2,3. ამან დიდწილად გაართულა ამ ვეზიკულების ნომენკლატურა და განმარტება (ჩანაწერი 1).

ცილების, ლიპიდების და რნმ-ის სპეციფიკური კომპლექტი შერჩევით არის ჩართული ვეზიკულების წარმოქმნის დროს, რომლებიც გამოიყოფა უჯრედგარე სივრცეში. ვეზიკულების მოლეკულური შემადგენლობა და მათი გამოთავისუფლების დინამიკა დამოკიდებულია ვეზიკულების სუბუჯრედურ წარმოშობაზე, დონორის უჯრედის ტიპზე და დონორის უჯრედის აქტივაციის სტატუსზე 2 . ეს იწვევს უჯრედების მიერ გამოთავისუფლებული ვეზიკულების რაოდენობასა და ხარისხში დიდ ჰეტეროგენულობას. უჯრედებიდან მიღებული ვეზიკულები შეიძლება იყოს მიზანმიმართული სხვა უჯრედებზე და მოახდინოს სიგნალი ცილებით შუამავლობითი რეცეპტორ-ლიგანდის ურთიერთქმედებით 4 , მოდულატორული ლიპიდების მოქმედებით 5 ან მარეგულირებელი (მცირე) რნმ 6 გადაცემით. ამრიგად, გადატანილი ვეზიკულების შემადგენლობა და რაოდენობა განსაზღვრავს, თუ როგორ იცვლება სამიზნე უჯრედების ფუნქცია.

კლინიკური თვალსაზრისით, უჯრედული ბუშტუკები საინტერესოა, რადგან ისინი გვხვდება სხეულის ბევრ სითხეში, როგორიცაა სისხლი 7,8, სპერმა 9,10, შარდი 11,12, ნერწყვი 13,14 და რძე 15,16. რამდენიმე კვლევამ აჩვენა ამ ვეზიკულების ბიომარკერული პოტენციალი, რაც საშუალებას იძლევა განვითარდეს დაავადების ახალი, არაინვაზიური სკრინინგის პროცედურები 8,12,17,18,19,20. გარდა ამისა, უჯრედგარე ვეზიკულები შეიძლება გამოყენებულ იქნას როგორც თერაპიული აგენტები 21,22. მაგალითად, კლინიკური ფაზის 2 ცდა, რომელიც იყენებს აუტოლოგიური დენდრიტული უჯრედის (DC) წარმოებული ეგზოზომების ფილტვის კიბოთი პაციენტების სამკურნალოდ, მიმდინარეობს 23,24. საბაზისო კვლევა, ბიომარკერების პროფილირება და უჯრედიდან მიღებული ვეზიკულების კლინიკური გამოყენება მოითხოვს მაღალი გარჩევადობის მეთოდებს ზუსტი რაოდენობრივი და ხარისხობრივი ვეზიკულების ანალიზისთვის.

მიუხედავად იმისა, რომ უჯრედებიდან მიღებული ვეზიკულების ზომა მერყეობს 50-დან 1000 ნმ-მდე, ვეზიკულების დიდი უმრავლესობა 300 ნმ-ზე მცირეა (იხ. 25,26,27). ეს სერიოზულად ართულებს ცალკეული ვეზიკულების ანალიზს. ამჟამად ხელმისაწვდომი ტექნიკა, რომელიც იძლევა ნანო ზომის ვეზიკულების ვიზუალიზაციის საშუალებას (ელექტრონული მიკროსკოპია, ატომური ძალის მიკროსკოპია) გამორიცხავს ვეზიკულების დიდი რაოდენობით ანალიზს, რაც საჭიროა რაოდენობისა და ჰეტეროგენურობის გასაანალიზებლად 25,26,28. პროტეომიკა, ლიპიდომიკა, მძივით დაჭერილი ვეზიკულების ნაკადის ციტომეტრია და ვესტერნი ბლოტი არის მძლავრი მეთოდები უჯრედული წარმოშობის ვეზიკულების ნაყარი იზოლატების მოლეკულური შემადგენლობის გასაანალიზებლად 29,30,31,32. თუმცა, ეს მეთოდები არ არის შესაფერისი ვეზიკულების პოპულაციების ჰეტეროგენურობის შესასწავლად, რადგან ვეზიკულების რაოდენობის ცვლილებები არ შეიძლება განსხვავდებოდეს ვეზიკულების მოლეკულური შემადგენლობის ცვლილებებისგან. ამჟამად, არ არის ცნობილი ცილები, რომლებიც კონსტიტუციურად დალაგებულია ვეზიკულებად, დამოუკიდებლად ვეზიკულის უჯრედული წარმოშობისა და მწარმოებელი უჯრედის აქტივაციის სტატუსისგან. უცვლელი „საყოფაცხოვრებო“ მარკერების ეს ნაკლებობა აფერხებს ვეზიკულების რაოდენობრივ ანალიზს ნაყარზე დაფუძნებული ანალიზის ტექნიკის გამოყენებით. აღსანიშნავია, რომ მცირე ცვლილებები კონკრეტულ ვეზიკულების ქვეჯგუფებში შეიძლება გამოსწორდეს ნაყარზე დაფუძნებული ანალიზით და, შესაბამისად, ადვილად შეუმჩნეველი იქნება.

ნანონაწილაკების თვალთვალის ანალიზი (NTA) არის შედარებით ახალი ტექნიკა ცალკეული ვეზიკულების ანალიზისთვის 28,33,34. NTA საშუალებას გაძლევთ ზუსტად განსაზღვროთ ვეზიკულის ზომა ბრაუნის მოძრაობის საფუძველზე. თუმცა, ჰეტეროგენული ზომის ვეზიკულების აუზის რაოდენობრივი განსაზღვრა ნაკლებად ზუსტია. გარდა ამისა, ვეზიკულების საერთო რაოდენობა, რომელთა თვალყურის დევნებაც შესაძლებელია და პარამეტრთა რაოდენობა, რომლებიც შეიძლება ერთდროულად გაანალიზდეს, შეზღუდულია 33 .

ნაკადის ციტომეტრია იდეალური ტექნიკაა ცალკეული უჯრედებისა და ნაწილაკების მაღალი გამტარუნარიანობის რაოდენობრივი და მრავალპარამეტრული დახასიათებისთვის. თუმცა, ნანო ზომის ვეზიკულების ანალიზში ბევრი ნაკადის ციტომეტრი აკლდება. ჩვეულებრივი ნაკადის ციტომეტრების უმეტესობისთვის, სინათლის გაფანტვის ქვედა გამოვლენის ზღვარი არის 300-500 ნმ (იხ. 35,36,37). გარდა ამისა, ამ ციტომეტრებს არ შეუძლიათ განასხვავონ ნაწილაკები, რომლებიც განსხვავდებიან <200 ნმ ზომით. რამდენიმე კვლევა აღწერს მორგებული ნაკადის ციტომეტრების გამოყენებას ნანო ზომის ნაწილაკების გამოსავლენად გაფანტვის საფუძველზე 38,39,40. გაფანტული სინათლის შეგროვებით 16°–70° კუთხით, პოლიმერული მარცვლები >74 ნმ და ვირუსის ნაწილაკები შეიძლება გამოვლინდეს ძალიან მაღალი გარჩევადობით 38 . თუმცა, ასეთი ხელნაკეთი მანქანები არ არის ხელმისაწვდომი მკვლევართა უმეტესობისთვის გამოსაყენებლად. კომერციულად ხელმისაწვდომი მაღალი დონის ნაკადის ციტომეტრების შედარებითი კვლევისას Apogee A40-ს ახლახან აჩვენა, რომ აქვს ყველაზე მაღალი მგრძნობელობა ნანო ზომის ნაწილაკების აღმოჩენისთვის 41 . მიუხედავად იმისა, რომ BD Influx ამ კვლევაში ნაკლებად კარგად მუშაობდა, აღწერილი BD Influx მანქანა არ იყო ოპტიმიზირებული მრავალი პარამეტრისთვის, რომლებიც გადამწყვეტია ნანო ზომის ნაწილაკების ანალიზისთვის.

ჩვენ ახლახან შევიმუშავეთ მაღალი გარჩევადობის ნაკადის ციტომეტრიაზე დაფუძნებული მეთოდი, რომელიც ცალსახად იძლევა ნანო ზომის უჯრედებიდან მიღებული ვეზიკულების რაოდენობრივ და მრავალპარამეტრულ ხარისხობრივ ანალიზს 42 . ამ მეთოდისთვის ჩვენ შევარჩიეთ BD Influx ნაკადის ციტომეტრი და გავაუმჯობესეთ ეს სისტემა 100 ნმ ზომის ნაწილაკების აღმოსაჩენად და საკმარისი გარჩევადობით, რათა ადვილად განასხვავოთ 100 და 200 ნმ ნაწილაკები სინათლის გაფანტვის საფუძველზე. BD Influx-ის განსაზღვრული ადაპტაციით და ფლუორესცენტური ვეზიკულების მარკირებისა და გაზომვის ოპტიმიზებული პროტოკოლით, ეს მეთოდი უპირატესობას ანიჭებს ნანო ზომის უჯრედებიდან მიღებული ვეზიკულების აღმოჩენასა და დახასიათებას.

მეთოდის აპლიკაციები

აქ აღწერილი მეთოდი იძლევა ცალკეული უჯრედებიდან მიღებული ნანო ზომის ვეზიკულების ანალიზს. ეს მეთოდი იძლევა ინტეგრირებულ ინფორმაციას მათი გამაძლიერებელი სიმკვრივის, სინათლის გაფანტვის შესახებ (დაახლოებითი და შედარებითი ზომისთვის), რაოდენობასა და ცილის შემცველობაზე. ამ პარამეტრების კომბინაციით, სხვადასხვა ვეზიკულური ქვეჯგუფების იდენტიფიცირება შესაძლებელია ჰეტეროგენულ პოპულაციებში. გარდა ამისა, შეიძლება გაანალიზდეს დინამიური ცვლილებები ნანო ზომის ვეზიკულების პოპულაციაში (მაგ., უჯრედული აქტივაციის საპასუხოდ). ჩვენ ვიმედოვნებთ, რომ ამ მეთოდის გამოყენება გამოიწვევს უჯრედებს შორის ვეზიკულური კომუნიკაციის ძირითადი ასპექტების უკეთ გაგებას. ამ მეთოდის გამოყენების კიდევ ერთი ძირითადი სფეროა ნანო ზომის უჯრედებიდან მიღებული ვეზიკულების ქვეჯგუფების დახასიათება, რომლებიც გვხვდება სხეულის სითხეებში, როგორც დაავადების ბიომარკერები. ნანო ზომის ვეზიკულები სხეულის სითხეებში შეიძლება მომდინარეობდეს სხვადასხვა ტიპის უჯრედებისა და ქსოვილების დიდი დიაპაზონიდან 2 . ამიტომ, მაღალი გარჩევადობის ტექნიკა, როგორიცაა ჩვენი ახალი ნაკადის ციტომეტრიაზე დაფუძნებული მეთოდი, მნიშვნელოვანია ვეზიკულების მთლიან პოპულაციაში მცირე ვეზიკულების ქვეჯგუფებში (პათოლოგიასთან დაკავშირებული) ცვლილებების გამოსავლენად. გარდა ამისა, ჩვენი მეთოდი შეიძლება გამოყენებულ იქნას თერაპიულ აგენტად გამოყენებული ვეზიკულების ხარისხის კონტროლის უფრო ზუსტ ანალიზზე. გარდა ნანო ზომის უჯრედებიდან მიღებული ვეზიკულების ანალიზისა, ეს მეთოდი ასევე იძლევა ~ 100 ნმ ზომის ლიპოსომებისა და ვირიონების 42 ანალიზის საშუალებას. აქედან გამომდინარე, ჩვენ წარმოვიდგენთ, რომ აღწერილ მეთოდს ასევე შეუძლია ახალი გამოყენება აღმოაჩინოს ვირუსოლოგიისა და ნანო-ნარკოტიკების განვითარების სფეროებში.

Ექსპერიმენტული დიზაინი

ნანო ზომის ცალკეული ნაწილაკების ნანოციტომეტრიაზე დაფუძნებული გამოვლენა. ჩვენ შევარჩიეთ jet-in-air-ზე დაფუძნებული BD Influx ნაკადის ციტომეტრი (თავდაპირველად შეძენილი როგორც Cytopeia Influx) ცალკეული უჯრედებიდან მიღებული ვეზიკულების ანალიზისთვის. საჰაერო ხომალდის სისტემები იძლევიან შედარებით მარტივ ხელით კორექტირებას ყოველი ექსპერიმენტის წინ, რაც აბსოლუტური მოთხოვნაა გაზომვებისთვის, რომლებიც აღწევს აღმოჩენის საზღვრებს. BD Influx-ის ადაპტირებული პარამეტრებით, ჩვენ შევიმუშავეთ მეთოდი განსაკუთრებით მაღალი მგრძნობელობით ფლუორესცენციისა და სინათლის გაფანტვის გამოვლენისთვის 42 . გამოყენებული ნაკადის ციტომეტრი აღჭურვილია მაღალი სიმძლავრის 488 ნმ ლაზერით (200 მვტ, შედარებით 25 მვტ-თან შედარებით ჩვეულებრივი სკამზე ნაკადის ციტომეტრებისთვის), რაც იწვევს გაფანტული სინათლის ინტენსივობის გაზრდას და ფტოროქრომების ოპტიმალურ აგზნებას მაქსიმალური ფლუორესცენტის მოსაპოვებლად. სიგნალი თითო ვეზიკულაზე. მიუხედავად იმისა, რომ ჰაერში დაფუძნებული ნაკადის ციტომეტრების გარჩევადობა ზოგადად უფრო დაბალია, ვიდრე კუვეტებზე დაფუძნებული სისტემები, გაზომვები ჰაერში დაფუძნებულ ციტომეტრებზე არ არის შეფერხებული მტვრის ან ჭუჭყის დაგროვების გამო კუვეტის ზედაპირებზე და ჩაძირვის გელები. უფრო მაღალი გამომავალი სიმძლავრის მქონე ლაზერების გამოყენება ნაწილობრივ ანაზღაურებს გარჩევადობის დაკარგვას.

ნაკადის ციტომეტრიაზე დაფუძნებული ვეზიკულების და 300 ნმ-ზე მცირე ნაწილაკების გამოვლენა ძლიერ შეფერხებულია ბუფერებიდან, ოპტიკიდან და ელექტრონიკიდან მიღებული ხმაურით. სინათლის გაფანტვის გადაფარვა ხმაურსა და ნანო ზომის ვეზიკულებს შორის გამორიცხავს ვეზიკულების დისკრიმინაციას სინათლის გაფანტვის საფუძველზე. როგორც ალტერნატივა, ჩვენ შევიმუშავეთ მეთოდი, რომლის დროსაც გამოიყენებოდა ფლუორესცენტური ზღურბლის ტრიგერები, რათა განასხვავოთ ფლუორესცენტურად მარკირებული ვეზიკულები არაფლუორესცენტური ხმაურისგან 42 . გარდა ამისა, გაზომვები ჩატარდა გარსზე დაბალი წნევის დროს, რათა გაზარდოს ვეზიკულების დგომის დრო ლაზერის სხივში, რითაც მაქსიმალურად გაზრდილიყო ამ ვეზიკულებით გამოწვეული ფლუორესცენციისა და გაფანტული სინათლის რაოდენობა 42 . ამ პარამეტრით, 100 ნმ ფლუორესცენტური მძივები შეიძლება გამოირჩეოდეს ხმაურის მოვლენებისგან ფლუორესცენციის 42-ის საფუძველზე (ნახ. 1a).

() ფლუორესცენტზე დაფუძნებული ზღურბლი გამოყენებული იყო ფლუორესცენტური 100 ნმ მძივების გასაანალიზებლად BD Influx ნაკადის ციტომეტრზე. წერტილოვანი ნახაზები წარმოადგენს ფლუორესცენციის დონეებს შემცირებული ფართოკუთხიანი FSC-ის წინააღმდეგ. დაბალი ფლუორესცენციის ზღურბლით, ხმაურის მოვლენები ჩანს (მარცხნივ). ფლუორესცენციის ზღურბლის ამაღლებით, ხმაურის მოვლენები შეიძლება აღმოიფხვრას (მარჯვნივ). () 100 და 200 ნმ ზომის ფლუორესცენტური მარცვლების ნარევს ჩაუტარდა ნაკადის ციტომეტრიული ანალიზი, როგორც ეს აღწერილია . () ლიპოპოლისაქარიდით სტიმულირებული თაგვის DC-ებით გამოთავისუფლებული ნანო ზომის ვეზიკულები ფლუორესცენტურად იყო მარკირებული PKH67-ით და წონასწორობის სიმკვრივემდე მიცურავდნენ საქაროზას გრადიენტში. გაერთიანებული 1,12-1,17 გ მლ -1 სიმკვრივის ფრაქციებიდან მიღებული ვეზიკულები დაექვემდებარა ნაკადის ციტომეტრულ ანალიზს ფლუორესცენტზე დაფუძნებული ზღურბლის გამოყენებით. მითითებულია წერტილოვანი დიაგრამა შემცირებული ფართო კუთხით FSC დონეების PKH67 ფლუორესცენციის წინააღმდეგ. () თაგვის CD4 + T უჯრედები ფლუორესცენტურად იყო მარკირებული ციტოპლაზმური საღებავით CFSE (2 μM). გამოთავისუფლებული ვეზიკულები (მარჯვნივ) ან (შუა) დამატებითი PKH67 ეტიკეტირების გარეშე გადაიტანეს წონასწორობის სიმკვრივემდე საქაროზის გრადიენტში. მითითებულია ფლუორესცენტური ვეზიკულების ანალიზი და დროზე დაფუძნებული რაოდენობრივი განსაზღვრა (მოვლენების რაოდენობა წერტილოვან ნახაზებში) 1,11–1,16 გ მლ −1 სიმკვრივის ფრაქციების აუზებში. წერტილოვანი ნახაზები წარმოადგენს შემცირებულ ფართო კუთხით FSC-ს ფლუორესცენტურად მონიშნული ვეზიკულების (შუა და მარჯვენა) ან PBS საკონტროლო ნიმუშის (მარცხნივ) ფლუორესცენტურ დონეებთან შედარებით. () თაგვების სისხლის პლაზმიდან გამოყოფილი ვეზიკულები, რომლებშიც EGFP გამოხატული იყო, როგორც ხსნადი ფლუორესცენტური პროტეინი, კონტროლის ქვეშ აქტინი პრომოუტერი 48 . ციტრატირებული პლაზმა ცენტრიფუგირებული იყო 30 წუთის განმავლობაში 2000-ზე და 30 წთ 10000-ზედა ვეზიკულები 60 წუთის განმავლობაში ცენტრიფუგაციის დროს 100,000. ვეზიკულები (მარჯვნივ) ან (შუა) დამატებითი PKH67 ეტიკეტირების გარეშე გადაიტანეს წონასწორობის სიმკვრივემდე საქაროზის გრადიენტში. მითითებულია ფლუორესცენტური ვეზიკულების ანალიზი და დროზე დაფუძნებული რაოდენობრივი განსაზღვრა (მოვლენების რაოდენობა წერტილოვან ნახაზებში) 1,15 გ მლ −1 ფრაქციაში. წერტილოვანი ნახაზები წარმოადგენს შემცირებულ ფართოკუთხიანი FSC-ის ფლუორესცენტურ დონეებს ფლუორესცენტურად მარკირებული ვეზიკულების (შუა და მარჯვენა) ან PBS საკონტროლო ნიმუშზე (მარცხნივ). პანელები გადაბეჭდილია ref. 42 Elsevier-ის ნებართვით.

მაღალი სიმძლავრის 488 ნმ ლაზერის გარდა, BD Influx-ზე აღჭურვილი მცირე ნაწილაკების დეტექტორი (SPD) ხელს უწყობს წინ გაფანტვის (FSC) გამოვლენის მაღალ მგრძნობელობას. SPD მოიცავს მაღალი ხარისხის ფოტო გამრავლების მილებს (PMT), რომლებიც უფრო მგრძნობიარეა ვიდრე ფოტოდიოდები, რომლებიც გამოიყენება ბევრ ჩვეულებრივ ნაკადის ციტომეტრებში. SPD-ის ლინზას აქვს მაღალი ციფრული დიაფრაგმა და გადიდების ფაქტორი, რაც საშუალებას აძლევს წინ მიმოფანტული სინათლის გამოვლენას უფრო ფართო მაქსიმალური კუთხით, ვიდრე ჩვეულებრივი ნაკადის ციტომეტრების უმეტესობა (ფართოკუთხიანი FSC). This improves the detection of nano-sized particles, which scatter light to larger angles 38,43,44 . By increasing the minimal FSC detection angle (reduced wide-angle FSC), the signal-to-noise ratio could be further improved 38 . By using these features, the reduced wide-angle FSC signal of 100-nm fluorescent polystyrene beads could be clearly detected above background levels, and 100- and 200-nm beads could be clearly detected as separate populations, further illustrating the high resolution for such small particles 42 (Fig. 1b). The reduced wide-angle FSC resolution was most optimal when using a large nozzle size (140 μm).

Side scatter (SSC, light scattered at 90°) has also been used for the analysis of small particles 45,46 . However, SSC is influenced to a higher degree than FSC by changes in the geometry and internal structures of small particles 44 . Notably, in our hands, the resolving power (change in light scatter with particle size) was higher for the reduced wide-angle FSC compared with SSC 42 . It should be noted, however, that FSC signals from nano-sized particles are not only determined by their size but also by other factors such as the refractive index and the shape of the particle 41,43 . Therefore, FSC signals can only be used for approximate and relative sizing of nano-sized particles 42 (Box 2).

To allow for interexperimental comparison of data, we implemented a strategy for calibration of the reduced wide-angle FSC, SSC and fluorescence signals. Fixed regions for 100-, 200- and 500-nm calibration beads in FSC/FL1 and FSC/SSC plots were defined and used to optimize the laser alignment at the start of each measurement 42 (see EQUIPMENT SETUP).

To summarize, flow cytometric detection of nano-sized particles requires high-power lasers, reduced wide-angle FSC measurements, a sensitive FSC detector (PMT) and fluorescence threshold triggering 42 . In theory, these features can be installed on any high-end flow cytometer. The BD Influx has an open architecture and can therefore easily be modified for small-particle detection. The flow cytometer brand and type will determine whether these adaptations can be easily implemented.

General vesicle-labeling strategy. Uniform and bright fluorescent labeling is a prerequisite for fluorescence threshold-based analysis of individual nano-sized vesicles. We experimentally determined that the brightest labeling of vesicles was achieved using the fluorescent membrane intercalating dye PKH67 (ref. 42). By using this dye, the vast majority of vesicles produced in an ინ ვიტრო DC culture could be detected, as evidenced by the fact that the density core of the vesicle population appeared well above the fluorescence threshold 42 (Fig. 1c). Indeed, slight lowering of the fluorescence threshold did not substantially increase the number of detected events. Although the current methodology heavily relies on efficient and homogeneous labeling of vesicles, we cannot formally exclude the possibility that vesicles harboring much less PKH67 are missed using this method.

We noticed that removal of unbound dye from the labeled vesicle fractions was very important. Simple washing by pelleting the vesicles by ultracentrifugation was not sufficient to remove dye aggregates. Floatation of vesicles up into density gradients or sedimentation through block gradients using ultracentrifugation has previously been used to separate vesicles from protein aggregates 4,47 . We observed that floatation up into sucrose gradients was crucial for separating the vesicles from unbound dye and did not induce substantial aggregation of vesicles. Floatation of vesicles into a sucrose gradient also allowed the separation of vesicle subsets on the basis of their differential buoyant densities and their subsequent characterization by flow cytometry. To control for the presence of unbound dye aggregates and nano-sized membrane particles in fresh culture medium, control experiments should be performed. These should include the comparison of material sedimenting at 100,000 from equal volumes of cell culture supernatant and fresh culture medium. Notably, culture medium should always be prepared with fetal calf serum (FCS) depleted from cell-derived vesicles and large protein aggregates (see REAGENT SETUP). We have applied the current protocol to analyze vesicles derived from ინ ვიტრო cultured DCs and T cells and different body fluids (see ref. 42 and the current protocol). On the basis of these results, we expect that the protocol is suitable for the analysis of vesicles from a wide range of cellular sources, as long as they are uniformly stained for fluorescence threshold triggering. As an alternative approach, we tested various strategies for labeling parental cells, resulting in the release of fluorescently labeled vesicles. This circumvents the vesicle-labeling step and allows for the direct analysis of vesicles from the cell culture supernatant after removal of cells and cellular debris. However, we identified several shortcomings of this approach. In the case of labeling cells with cytoplasmic dyes, such as calcein and 5,6-carboxy-succinimidyl-fluoresceine ester (CFSE), we experienced that high cell labeling concentrations of the dye were required to obtain vesicles containing sufficient fluorescence to be detected above the fluorescence threshold. However, such high dye concentrations (e.g., 5 μM for CFSE) were detrimental to the function of immune cells. Moreover, the level of fluorescence of CFSE-labeled vesicles was much lower in comparison with PKH67-labeled vesicles and only vesicles high in FSC, which may represent larger vesicles, could be detected above the threshold (Fig. 1d). In addition, the fluorescence level of vesicles released from cells in which EGFP was expressed as soluble fluorescent protein under the control of the აქტინი promoter 48 (a kind gift from R.E. Mebius, Vrije Universiteit Medisch Centrum, Amsterdam) was lower compared with PKH67-labeled vesicles. As a result, the majority of these GFP-labeled vesicles could not be detected above the threshold (Fig. 1e). Improved fluorescent labeling may in the future be achieved by GFP tagging of those proteins that are specifically and constitutively sorted into vesicles.

In conclusion, we found that the PKH67 dye was optimal for obtaining brightly labeled vesicles, which were well detected above a fluorescence threshold that eliminated nonfluorescent noise. Purification of labeled vesicles by ultracentrifugation between sucrose layers or into sucrose gradients was crucial for separating vesicles from unbound dye.

Characterization by antibody labeling. In addition to the characterization of vesicles on the basis of light scatter and PKH67 fluorescence, vesicles can be further characterized by staining with fluorochrome-conjugated antibodies. This allows further identification of different vesicle subsets within heterogeneous pools of vesicles. The surface area of a vesicle is multiple orders of magnitude smaller than cells, which limits the overall labeling intensities. The ability to detect certain proteins is therefore largely dependent on the abundance of this protein on the vesicle surface, the affinity of the antibody for this protein, the number of fluorochromes conjugated to the antibody and the brightness of fluorochromes. As a consequence, the presence of low-abundance proteins might be overlooked using the current methodology. We therefore aimed to use antibodies conjugated to the brightest available fluorochromes, such as B-phycoerythrin (B-PE) and R-PE, which have high extinction coefficients and quantum yields. By using an R-PE-conjugated antibody, we could detect MHCII on the surface of nano-sized vesicles from mouse DCs (Fig. 2a) 42 . We experienced that antibodies conjugated to less-bright fluorochromes, such as allophycocyanin (APC) or Alexa Fluor 647, could be used only in case of sufficient abundance of proteins and high-affinity antibodies. To analyze heterogeneities in vesicle subsets, we combined an APC-labeled antibody against the highly abundant MHCII with a B-PE–labeled antibody specific to milk-fat globule-epidermal growth factor 8 (MFG-E8). This multicolor labeling strategy allowed us to demonstrate large differences in the protein composition of vesicle populations derived from lipopolysaccharide (LPS)-activated and nonactivated DCs (Fig. 2b) 42 . Ongoing improvement of dyes and detectors over a broader range of the light spectrum will allow the detection of lower-abundance proteins and the use of lower-affinity antibodies.

Nano-sized vesicles released by nonactivated or LPS-activated mouse DCs and labeled with PKH67 were additionally stained with fluorochrome-labeled specific antibodies or isotype control antibodies and floated to equilibrium density into a sucrose gradient. The vesicles in the collected sucrose gradient fractions were measured using fluorescence threshold triggering. () Dot plots represent PKH67 labeling and isotype control (left) or anti-MHCII-R-PE (right) antibody (Ab) staining of vesicles derived from LPS-activated DCs (pools of 1.11–1.18 g ml −1 sucrose fractions). () Dot plots represent anti-MFG-E8 (B-PE-labeled)/anti-MHCII (APC-labeled) double-labeled vesicles derived from LPS-activated (middle plot) or nonactivated (right plot) DCs. As a negative control, vesicles were stained with rat APC-conjugated isotype control and B-PE–labeled rat anti-CD4. This figure is reprinted from ref. 42 with permission from Elsevier.

Quantification of nano-sized vesicles and particles. The flow of particles is hydrodynamically focused in the center of the sheath fluid. This forces larger particles (e.g., cells) to pass the lasers one by one, which is needed for accurate quantification. Smaller particles such as nano-sized vesicles have a greater freedom of space in a core stream of the same diameter. This could allow the simultaneous passage of two or more particles through the laser beam. Furthermore, it enables the particles to pass at different interrogation positions of the laser. It was therefore crucial to analyze vesicle samples at low sample pressure. This reduced the core stream diameter and forced the nano-sized particles to pass the laser at a more-defined position. At rates below 10,000 events per second, relevant numbers of stored events could be combined with a relative low coincidence of particles. Furthermore, the electronics did not show relevant aborts at this rate.

By using these settings, we showed that nano-sized particles could be accurately quantified within a large range of concentrations 42 . We tested this by measuring serial dilutions of 100-nm beads mixed with a fixed number of 200-nm reference beads (Fig. 3a). Care should be taken when using reference beads to spike biological samples. We found that some of the biological nanoparticles stuck to the reference beads, thereby hampering quantification. We therefore developed an alternative protocol for quantification that uses a fixed time frame 42 (see PROCEDURE). This allowed us to quantify absolute numbers of 100-nm beads over a broad range of concentrations (Fig. 3b). In addition, cell-derived vesicles present in sucrose gradient fractions could be quantified using this time-based quantification protocol (Fig. 3c). For quantitative comparison of different samples, sheath and sample pressure must be optimized and kept constant, allowing the measurement of all samples within the constraints of the core diameter and the maximal accepted event rate.

() Serial twofold dilutions of fluorescent 100-nm beads were mixed with a fixed number of fluorescent 200-nm beads. Samples were measured using fluorescence threshold triggering, and the absolute numbers of 100- and 200-nm beads were analyzed. Expressed is the ratio of 100-nm beads versus 200-nm beads at each dilution (slope –0.9637 ± 0.064, 2 = 0.999, as determined by linear regression). One representative experiment out of three is shown. () Serial twofold dilutions of fluorescent 100-nm beads were prepared and measured using fluorescence threshold triggering. The absolute number of beads measured in a fixed time window (30 s) was plotted against the dilution factor (slope −1.012 ± 0.012, 2 = 1.00, as determined by linear regression). The measured values (black diamonds) are plotted together with the calculated amount of input beads (′×′ symbol) on the basis of the specified concentration of beads in the stock solution. One representative experiment out of three is shown. () Time-based quantification of PKH67-labeled vesicles derived from CD4 + T cells (black bars) detected in different sucrose gradient fractions. Indicated are the numbers of events measured in 30 s. Gray bars represent the number of events detected in control gradients containing 100,000-sedimented material from fresh culture medium and unbound PKH67 aggregates. Panels და are reprinted from ref. 42 with permission from Elsevier.

Limited potential for sorting nano-sized vesicles. Although the use of a jet-in-air–based system opens up the possibility of sorting, the currently described adaptations of the flow cytometer for the analysis of nano-sized vesicles do not allow efficient sorting of these vesicles. The use of a large nozzle diameter and low pressure, necessary for improved detection of individual nano-sized particles, determines a large sort envelope compared with the size of the vesicle, while the drop frequency is low. This implies that sorts can only be performed at low event rates. Consequently, long sorting times will be required to obtain sufficient numbers of vesicles for further analysis. Furthermore, the sorted fraction will have an unfavorable low concentration of particles owing to the high volume of the sorted drop in relation to the size of the vesicle. To optimize the sorting of nano-sized vesicles, fine-tuning with smaller nozzle sizes and higher pressure will be necessary.


დიზაინი

The overall design for Flow is based on the Model-View-Controller (MVC) design pattern [8] that separates the visual display and controls from the data model cleanly. The core of the Model is implemented using HDF5 [9], which provides a well-documented and flexible API for hierarchical data structures, augmented with functions to process the data through various statistical procedures. The Views and Controllers are implemented by hooking up a portable graphical user interface toolkit to the Model using the event-driven model provided by all such toolkits.

Flow is developed primarily in Python, a dynamic object-oriented programming language. Python was chosen because it is open-source and has modules to handle common tasks, as well as excellent numerical and scientific support with the numpy and scipy modules [10]. Choosing a high level language reduced development time and made it easy to port the application to multiple operating systems.

Core routines in the base system handle data management, while plugins for IO, statistics and visualization provide the remaining functionality. This decoupling facilitates independent development of new functionality, and encourages an evolutionary approach to software development. The extensibility of Python allows such plugins to be developed in a variety of languages. For example, several of the current plugins take advantage of this by using C/C++ for computationally intensive routines and R for specific statistical algorithms. As a result, developers can easily implement new functionality to fit their specific needs. However, the demarcation between plugins and base system is mainly relevant for developers plugins are integrated into the system in such a way as to be essentially transparent to the user.


Alternatives to commercially available flow cytometric analysis software for use in cell cycle analysis? - ბიოლოგია

A comprehensive review of assays for the cell cycle, and the results from a Labome survey of formal publications.

The cell cycle is the process by which eukaryotic cells duplicate and divide. The cell cycle consists of two specific and distinct phases: interphase, consisting of G1 (Gap 1), S (synthesis), and G2 (Gap 2), and the mitotic phase M (mitosis) (Figure 1). During interphase, the cell grows (G1), accumulates the energy necessary for duplication, replicates cellular DNA (S), and prepares to divide (G2) [2]. At this point, the cell enters the M phase, which is divided into two tightly regulated stages: mitosis and cytokinesis. During mitosis, a parent cell's chromosomes are divided between two sister cells. In cytokinesis, the division of the cytoplasm occurs, leading to the formation of two distinct daughter cells. Each phase of the cell cycle is tightly regulated, and checkpoints exist to detect potential DNA damage and allow it to be repaired before a cell divides. If the damage cannot be repaired, a cell becomes targeted for apoptosis. Cells can also reversibly stop dividing and temporarily enter a quiescent or senescent state G0. The first checkpoint is at the end of G1, making the decision if a cell should enter S phase and divide, delay division, or enter G0. The second checkpoint, at the end of G2, triggers mitosis if a cell has all the necessary components.

Several methods to assess the cell cycle are discussed below. However, it is important to remember that these methods are not mutually exclusive, and for the best and most reliable data multiple dyes and/or analytes can be combined in a single experiment or multiple assays used.

The most common method for assessing the cell cycle is to use flow cytometry to measure cellular DNA content. During this process, a fluorescent dye that binds to DNA is incubated with a single cell suspension of permeabilized or fixed cells. Since the dye binds to DNA stoichiometrically, the amount of fluorescent signal is directly proportional to the amount of DNA. Because of the alterations that occur during the cell cycle, analysis of DNA content allows discrimination between G1, S, G2 and M phases. The simple protocol for cellular analysis is outlined in Figure 2. Briefly, cells are fixed and permeabilized to allow the dye(s) to enter the cell and to prevent them from being exported out. Staining with the DNA binding dye then occurs after cells have been treated with RNase to ensure only DNA is being measured. Several datasets, including forward scatter vs. side scatter, pulse area vs. pulse width, and cell count vs. propidium iodide, are collected to ensure only single cells are measured. Examples of these traces are shown in Figure 3.

There are several different dyes that can be used in these assays, including propidium iodide (PI) [3, 4], 7-amino actinomycin-D (7-AAD), Hoechst 33342 and 33258, and 4’6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI). For example, Chopra S et al labeled mouse bone marrow–derived dendritic cells and paw single cell suspensions with 0.5 μg/ml DAPI from Thermo Fisher during flow cytometry on a BD LSR II instrument and cell sorting with a BD Aria II SORP cell sorter [5]. Zhang H et al combined mitosis-specific anti-pMPM2 antibody ( 05-368 from MilliporeSigma) staining with DAPI to obtain prometaphase cells through FACS [6]. However, most FACS machines commonly used contain only single argon-ion lasers, and as such dyes requiring UV activation such as DAPI and Hoescht 33342 are less frequently used. A derivative of Hoechst dye, SiR-Hoechst, has excitation at 640 nm, and thus may find widespread use [7]. Hoechst 33258 has also been used to image polycomb bodies [8]. Rhodes JDP et al estimated the proportion of mitotic cells through antibody staining of serine 10 phosphorylated histone H3 in FACS [8]. Phosphorylated histone H3 staining has also been used in immunohistochemistry to identify mitotic cells in mouse [9, 10] and killifish [11].

When carrying out these analyses, it is important to recognize that simple single stained FACS analysis using 7-AAD or PI is unable to distinguish between cells in G1 or G2 from those in very early or very late S phase, and similarly those in G2 or M. It is therefore sometimes necessary to combine these dyes with a proliferative marker such as BrdU [3]. For example, Calvanese V et al combined 7AAD and BrdU-PE staining in flow cytometry to assess the cell cycle stages of cultured hematopoietic stem or progenitor cells [12]. This requires additional steps at the beginning of the study, where live cells still in culture are incubated with BrdU for a period of approximately 30 minutes, before incubation with anti-BrdU and fluorescence-conjugated secondary antibodies. Cells are then assayed as described above.

There are a number of important considerations when carrying out analysis of cell cycle FACS data. The forward scatter/side scatter plots are an integral part of the analysis and should not be overlooked, since this is how single cells are identified. If doublets (when the DNA content of two cells in G1 are recorded as a single G2/M event) are allowed in the analysis, it can lead to over-representation of G2/M. Cellular aggregates and flow rates below 1000 cells/second should also be avoided to allow a low sample pressure differential to be used, which leads to an optimal coefficient of variance (CV). Finally, reference samples containing normal diploid DNA should be included as an additional control.

The Nicoletti assay [13] is a modified form of cell cycle FACS analysis that concurrently allows apoptosis to be assessed by measuring cells with low intact DNA content, and high fragmented DNA content [14] (the pre-G1 peak). The Nicoletti method is very similar to that described above, with the exception that a hypotonic buffer (such as HFS buffer containing sodium citrate and Triton X-100, or a hypotonic fluorochrome solution) is used to permeabilize the cells. Apoptotic cells stain weaker in these assays due to the activation of cellular nucleases and the diffusion of low molecular weight DNA out of the cell. Fixing and permeabilizing cells stimulates the release of oligo- and mononucleosomes. The use of a hypotonic buffer facilitates the loss of fragmented DNA, resulting in a shift of the pre-G1 peak.

The images in Figure 4 demonstrate healthy cells (top), cells in which a sub-population is beginning to undergo apoptosis (middle), and a population of cells with extensive apoptosis (bottom). However when using the Nicoletti assay, care must be taken to discriminate apoptotic nuclei from cell debris, and to ensure that DNA shearing does not occur during the fixing and staining processes.

The cyclins are key regulatory components of the cell cycle machinery. The cyclin family comprises the classical cyclins, cyclin-dependent kinases [15, 16] (CDKs) and Cdk inhibitors (CKIs). Although there is much redundancy between the individual cyclins and CDKs [17], the activity and expression of the individual proteins fluctuate during each distinct phase of the cell cycle, playing an important regulatory role. Although this is a complex and highly regulated process, in general cyclins can be divided into sub-groups governed by the phase of the cell cycle they regulate, summarized in Figure 5. For example, Cyclin D1 is required for the passage of cells from G0 to G1. Once expressed, it forms a complex with Cdk4, which activates retinoblastoma protein, leading to the upregulation of Cyclin E. Cyclin E, in combination with cyclin A, then interacts with Cdk2 to promote G1/S transition. In contrast, cyclins B1 and B2 are expressed during M phase where they interact with Cdk1 to form part of the MPF (M phase/maturation promoting factor), an assembly that regulates a cascade of processes leading to mitotic spindle assembly and ultimately cell division. The expression of each human cyclin and their interaction with Cdks are summarized in table 1.

ციკლინი Peak phase expressed Cdk binding partners სამი საუკეთესო მომწოდებელი
G1Cdk4, Ckd6CCND1:Invitrogen MA1-39546 (335), Cell Signaling Technology 2978 (93), Santa Cruz Biotechnology sc-20044 (38)
G1/SCdk2CCNE1:Santa Cruz Biotechnology sc-247 (41), Cell Signaling Technology 4129 (36), Invitrogen MA5-14336 (22)
S/G2Cdk1, Cdk2CCNA1:Cell Signaling Technology 4656 (23), Santa Cruz Biotechnology sc-271682 (5), R&D Systems MAB7046 (2)
Cdk1CCNB1:Santa Cruz Biotechnology sc-245 (87), Cell Signaling Technology 4135 (32), Invitrogen MA5-14319 (23)

These distinct expression patterns can therefore be exploited during cell cycle analysis. The total levels and/or phosphorylation status of individual cyclins can be easily and rapidly measured using specific antibodies by immunoblotting [3]. In addition, specific ELISA kits are available for individual cyclin family components, allowing for a more quantitative assessment of expression. Finally, fluorescently conjugated antibodies can be used in immunohisto- or immunocyto-chemical approaches, or in flow cytometry. Combining cyclin staining with FACS methods examining DNA content provides a powerful and quantitative tool to analyze the cell cycle accurately [3].

Tetraploid cells are associated with the formation of malignancy and often possess the stem-cell characteristics. Thus, with relevance to cancer biology [18, 19] and regenerative tissue homeostasis [20], it is conceivable that the analysis of tetraploid cells would be of importance. The tetraploid G1 cells and diploid G2/M cells are difficult to detect as they possess the same ploidy that is 4C DNA content.

FUCCI (Fluorescence ubiquitination-based cell cycle indicator) system is a technology that utilizes the cell cycle phase-specific expression of proteins and their degradation by the ubiquitin-proteasome degradation system [21, 22]. The technology analyzes the living cells in a spatio-temporal manner using dual-color protein-fluorescent chimeras. Moreover, it enables to overcome the problem of isolating the cells in different phases, which is otherwise difficult to differentiate only with the DNA-based stains such Hoechst. It is composed of two proteins - Cdt1 (Cdc10 dependent transcript 1) and Geminin. Both proteins are used in their truncated forms (hCdt1 and hGeminin) and are conjugated to two different fluorescent proteins. They express alternately in the two different cell cycle phases. Cdt1 is a conserved replication factor required for licensing the chromosome for DNA synthesis. Cdt1 is expressed throughout the G1 phase and is ubiquitinated by the ubiquitin ligase complex SCFSkp2 during S and G2/M phases followed by its degradation by the proteasome. In contrast, geminin inhibits the licensing activity of Cdt1 by interfering with the binding of licensing factors to the replication origin during the S phase. It is present during S/G2/M phases. At the end of M phase and throughout the G1 phase, geminin is ubiquitinated by the E3 ligase complex APCcdh1 and degraded by the proteasome [21].

Მიმწოდებელი ნაკრები ცნობები
Caltag MedsystemsFUCCI
MBL Life SciencesFUCCI [23]
Takara Pharmaceuticals FUCCI vectors
ThermoFisher Scientific Premo™ FUCCI Cell Cycle Sensor (BacMam 2.0) [24, 25]

Figure 6 depicts the scatterplot representing the live cells expressing different fluorochromes implying their diverse cell cycle phases. Depending on the probe selection, the two chimeras emit different fluorescence. Several probes are available commercially. One of the examples is stated below along with a diagram. Fucci-G1 Red is a fusion protein of a fragment of human Cdt1 (amino acids 30-120) with the red fluorescent mCherry-RFP, that detects the cells in G1 phase. Fucci-S/G2/M Green is a fusion protein of a fragment of human geminin (amino acids 1-110) with the green fluorescent protein mAG1 (monomeric Azami-Green1) that visualizes S, G2 and M phases. Thus, the G1 tetraploids emit red fluorescence and G2/M tetraploids emit green fluorescence. By employing this technology, it is also possible to distinguish between the mononucleated diploid cells from the binucleated cells.

Table 2 lists some of the commercial suppliers of FUCCI kits. The FUCCI sensors from Thermo Fischer Scientific, for example, were used to analyze G1 phase in mouse stem cells and evaluate mechanisms of UV-mediated damage [24] and investigate the awakening and proliferation of dormant metastatic cells by neutrophil extracellular networks [25]. M Barnat et al obtained pCAG-Geminin-GFP and pCAGCdt1-mKO2 from A. Miyawaki, RIKEN Brain Science Institute, Japan [10].

One of the limitation of the FUCCI system is that these systems requires the expression of multiple reporter constructs intracellularly and reduces the chance to image other targets spectrally. This problem has been overcome by modification of this system. Zerjatke et al developed fluorescently tagged endogenous proliferating cell nuclear antigen (PCNA) as an all-in-one cell cycle reporter. This reporter with PCNA-mRuby alters in brightness and localization in different phases. Consequently, it provides a readout of the cell cycle phase including quiescence and quantitative dynamics of individual fate determinants of cell cycle regulation [26].

Another limitation is that FUCCI system and its variants allow visualizing whether cells are within one of the proliferative phases (S, G2, or M) of the cell cycle, they do not report simultaneous visualization of the three phases cells in real time. Bajar et al developed a robust method that enables simultaneous imaging of the all four phases. They established an intensiometric reporter for the S/G2 transition and further engineered a far-red fluorescent protein, mMaroon1, to track the process of mitotic chromatin condensation. They designed a new version called Fucci4 by combining the new reporters with the FUCCI system and incorporating four orthogonal fluorescent indicators that enable to capture all cell cycle phases in the living cells [27]. Fucci4 has diverse applications in development, physiology, and cancer. Fucci4 allows 1) how diverse changes at the molecular, genetic and extracellular signaling level alter the cell cycle, 2) molecular mechanisms regulating specific phase transitions and 3) screening for drugs that affect a particular cell cycle phase or cell cycle distribution.

There are several applications of FUCCI system in various branches of biology and medicine. For studying development biology, Sugiyama et al generated transgenic Zebrafish lines expressing the non-mammalian FUCCI counterparts [28]. They were employed to study the spatio-temporal regulation of cell-cycle progression during major morphogenetic events/processes (gastrulation, metamorphosis, involution, invagination and branching) [21, 29]. Zielke et al engineered Drosophila-specific FUCCI system (Fly-FUCCI) that involves tissue-specific expression of the FUCCI probes [30]. This allows one to distinguish G1, S, and G2 phases of interphase. This serves as a valuable tool for visualizing cell-cycle activity during development, tissue homeostasis, and neoplastic growth.

The FUCCI system can be used in tumors for in vivo cell cycle profiling by stably transfecting cell lines with FUCCI reporters and development of the xenograft tumors [31]. Nico Battich et al correlated the synthesis and degradation rates of mRNAs along the cell cycle indicated by the FUCCI system [32].

Sawano et al re-engineered the Cdt1-based sensor from the original Fucci system to respond to S phase-specific CUL4Ddb1-mediated ubiquitination alone or in combination with SCFSkp2-mediated ubiquitylation. This system is known as Fucci(CA) and it demarcates interphase with boundaries between G1, S, and G2. The applications of Fucci(CA) included tracking the transient G1 phase of rapidly dividing mouse embryonic stem cells and identifying UV-irradiation damage in S phase [24].

Several new reagents for cell cycle analysis, such as chromobodies and Cycletest reagent, have recently been developed. Chromobodies are fusion proteins, which contain fluoresceins linked to the antigen binding domain of heavy chain antibodies. These reagents are used to detect the expression of various intracellular proteins within the cellular compartments and dynamic changes of their distribution during different phases of the cell cycle. Furthermore, chromobodies can be applied for the detection of both cytoskeletal and nuclear proteins. With regard to cytoskeletal target proteins, changes in vimentin expression have been analyzed by specific chromobodies in a study that generated vimentin knock-out cell line [33]. As to the analysis of nuclear proteins by chromobodies, Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA), which plays a crucial part in the replication process in the nucleus, was detected by the red fluorescent protein-bound chromobody [34]. Also, an advanced modification of PCNA detection by chromobodies, which was based on 4D quantitative analysis of the PCNA expression and distribution during the replication phase, has recently been reported [35].

Moreover, chromobody assays can be combined with other techniques. For example, a combination of chromobody-based analysis of the cell cycle with the Chto Tox-Glo cytotoxicity method has been described. In that study, the visualization of PCNA expression in subcellular compartments by chromobodies was followed by the evaluation of protease activity ინ ვიტრო [36]. With regard to the applications of chromobodies for in vivo research, the chromobody-based method has been originally applied to studies in zebrafish [37]. In addition, Wegner et al have analyzed the expression of actin in the mouse brain using anti-actin chromobodies labelled with fluorescent protein mNeptune2. [38].

მომწოდებლებიreagents/kits მეთოდები sample references
ბექტონ დიკინსონი7-amino-actinomycin D [39]
BioLegendCytoPhase violetflow cytometry [40]
MilliporeSigma7-amino-actinomycin D [41]
MilliporeSigmaHoechst 33258 [42]
MilliporeSigmaHoechst 33342 [39]
MilliporeSigmapropidium iodide
თერმო ფიშერი7-amino-actinomycin D [43]
თერმო ფიშერიHoechst 33258 [44]
თერმო ფიშერიHoechst 33342
თერმო ფიშერიpropidium iodide

In addition, Cycletest PLUS reagent kit produced by BD Biosciences is recommended for cell cycle analysis. This method includes the elimination of the cell membrane and cytoskeleton with a detergent and trypsin, respectively, followed by the digestion of RNA and stabilization of the chromatin. The kit contains propidium iodide (PI), which binds to the extracted nuclei. The stained nuclei are analyzed by flow cytometry to measure the binding of PI to DNA. This reagent was successfully used in several recent studies. For instance, Cycletest has been applied to evaluate the anti-tumor effects of thymoquinone in human breast tumor MCF-7 cells [45] and the effects of α-solanine in colorectal tumor cells [46].

This section is provided by Labome to help guide researchers to identify most suited cell cycle analysis assay kits. Labome surveys formal publications. Table 3 lists the major suppliers for reagents/kits used in the cell-based assays and their numbers of publications in the Labome survey. The review article on cell proliferation lists the survey results on BrDU.

This article is derived from an earlier version of an article authored by Dr. Laura Cobb "Cell-Based Assays: the Cell Cycle, Cell Proliferation and Cell Death", written in February 2013. Dr. Samayita Das contributed to the section on the FUCCI system in September 2019.


Flow-Cytometric Method for Viability Analysis of Mycoplasma gallisepticum and Other Cell-Culture-Contaminant Mollicutes

Mycoplasma is the smallest self-replicating bacteria, figuring as common contaminant of eukaryotic cell cultures. Production inputs and operator’s manipulation seem to be the main sources of such contamination. Many analytical approaches have been applied for mycoplasma detection in cell cultures and also in biological products. However, unless they were validated, only indicator cell culture and bacteriological culture are considered as compendial methods for quality control of biological products. Nano-flow cytometry has been pointed out as an alternative technique for addressing prokaryotic and eukaryotic cell viability being a substantial tool for reference material production. In this study, a viability-flow-cytometry assay was standardized for M. gallisepticum and then applied to other cell-culture-contaminant mycoplasmas. Ამისთვის, M. galliseticum’s growth rate was observed and different treatments were evaluated to establish low viability cultures (cell death-induced control). Distinct viability markers and their ideal concentrations (titration) were appraised. Ethanol treatment showed to be the best death-inducing control. CFDA and TOPRO markers revealed to be the best choice for detecting live and dead mycoplasma frequencies, respectively. The standardized methodology was applied to Mycoplasma arginini, M. hyorhinis, M. orale, Spiroplasma citri და Acholeplasma laidlawii. Significant statistical difference was observed in the percentage of viable cells in comparison to ethanol treatment for A. laidlawii in CFDA and in both markers for M. gallisepticum, M. hyorhinis და S. citri. In summary, we standardized a flow cytometry assay for assessing M. gallisepticum − and potentially other species – viability and ultimately applied for reference material production improving the quality control of biological products.

ეს არის გამოწერის შინაარსის გადახედვა, წვდომა თქვენი დაწესებულების მეშვეობით.